K-B纸片扩散法药敏试验技术要点

K-B纸片扩散法药敏试验技术要点

王莉

王莉（新疆阿拉尔市人民医院检验科843300）

【关键词】细菌药敏试验K-B纸片扩散法

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）25-0059-02

近年来，由于抗生素、磺胺等抗菌药物广泛应用，导致了耐药菌株不断出现，正确、准确测定细菌对药物的敏感程度，对于临床治疗中选择用药、避免滥用药、及时有效地控制感染以及细菌鉴定，具有重要意义。

目前，细菌对抗生素敏感试验（以下简称药敏试验）的方法主要有：Etest法、稀释法、Kirby-Bauer法（以下简称K-B纸片扩散法）以及运用全自动微生物分析仪（Vitek、ATB等）进行药敏测试。但WHO推荐的是K-B纸片扩散法，因此方法具有多重优点，如重复性好、操作简单、试验成本相对较低、结果直观、容易判读、便于基层开展等。K-B纸片扩散法受药敏纸片质量、细菌浓度与纯度、培养基等诸多因素的影响较大[1]，如何提高K-B纸片扩散法药敏试验的准确性，现从以下几点加以阐述：

1药敏纸片

1.1药敏纸片的选择选择厚度为1mm左右的纸片，这样适合药物的扩散速度和细菌的生长，直径为6.00-6.35mm,药敏纸片的厚度过厚、过薄或直径过大、过小均会影响药敏试验的结果。

1.2药敏纸片的保存将药敏纸片放入密封的容器内，置于无霜冰箱中，常用药于2-8℃冷藏，不常用者-20℃冷冻至使用前。ß-内酰胺类药物纸片应密封包装并冷冻。某些不稳定的药物（如亚胺培南，克拉维酸复合药等）应分装冷冻保存，以尽量保持其稳定性。装有药敏纸片的容器应于使用前1-2小时移出冰箱，平衡至室温后才能打开，避免冷凝水影响药效。

1.3药敏纸片的贴放贴药敏纸片时，不管纸片是单个贴加还是用分配器加，都应均匀分布，使其中心间距不小于24mm，距平板边缘不小于15mm，一般情况下，90mm平板所贴纸片不应超过6个，以保持纸片周围浓度梯度的相对稳定，避免不同药物相互干扰，防止抑菌圈边缘交叉以免影响结果判读。因为有些药物几乎会立即扩散，所以纸片一旦接触了琼脂表面，就不应再挪动位置，而应该在需要的地方贴新的纸片。

贴完纸片后，应在15分钟内，将平板反转过来，置于35℃空气温箱中。但嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌和链球菌药敏平板应置5%CO235℃孵育。

2菌液

2.1菌液的浓度对于任何细菌的药敏试验，将提纯的细菌配置成适当的浓度是得到正确结果的基本保证，菌液浓度过高会出现假性耐药，过低则会出现假性敏感。用分光光度计法测量菌液浓度非常精确，但无条件的中、小实验室仍采用麦氏比浊法：直接用肉汤或0.9%生理盐水制成悬液，调整至0.5麦氏标准管，或使用比浊仪调成0.5麦氏单位的标准菌液浓度。

2.2菌液纯度由于各种细菌对药物的敏感性不同，产生的抑菌圈大小不同，若菌种不纯，试验中产生的抑菌圈大小与该菌纯培养状态下产生的抑菌圈存在较大差异，影响结果准确性，因此必须提纯各种致病菌，分别对其进行不同的药敏试验，临床医师才能综合药敏实验结果选择用药[2]。

2.3菌液的接种量细菌接种量是药敏试验结果产生较大差的原因之一，余修中[3]在K-B纸片扩散法药敏试验菌液量的规范研究中提出固定接种0.35ml菌液量的规范。到目前为止，NCCLS推荐使用的是采用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的接种菌液。然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次将平板转动约60度，最后用棉拭子涂抹琼脂的边缘，对接种菌量未做客观要求。鉴于上述情况，建议在进行药敏试验用棉拭子涂布时，尽量保证选用同一品牌、大小相同的棉拭子，以减少误差，确保药敏试验的准确可靠。

3培养基

3.1培养基的选择药敏试验中，为保证结果重复性及抑菌环的大小清晰，应选择对抗生素及磺胺药物无拮抗剂的培养基。水解酪蛋白（Mueller-Hinton,MH）培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，PH为7.2-7.4，临床实验室常规敏感试验，除了检测容易生长的在M-H培养基的需氧、兼性厌氧菌外，尚有许多不能在M-H培养基上生长或生长不良的菌株。如链球菌属、流感嗜血杆菌及淋病奈瑟菌。培养基内必须补充特殊的营养成份。流感嗜血杆菌应选用嗜血杆菌试验培养基（HTM）[4]；肺炎链球菌和其他链球菌所用培养基是在M-H琼脂中加5%脱纤维羊血。

3.2培养基的质量目前临床多用4mm厚（及90mm平板准确倒入25ml琼脂液）平板，如此控制平板厚度可满足试验要求。有研究证明，平板每增厚或减薄1mm，抑菌圈相应减小或增大0.7mm。为保证培养基质量，每新配置或新批号的培养基在检测之前，都用全部常用抗生素进行质控检测，在控时方能使用进行试验。

4判读平板和结果解释

4.1检查平板孵育16—18小时后，检查每一块平板，如果平板划线满意，接种物准确无误，抑菌圈应为正圆形，菌落应相互融合生长。如果出现明显的单个菌落，是因为接种量太少，必须重复试验。

4.2直径测量MH琼脂培养基——用游标卡尺，尺子或特制的模板，将尺子置于反转的平板的背面，测量完全抑制区域的直径（肉眼判读），包括纸片的直径，到最接近的整数毫米数。平板应距离一个黑色不反光的背景数英寸，并用反射光照明。

4.2.1如果是加血的MH琼脂培养基（如对链球菌），则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从上表面测量抑菌圈。

4.2.2如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育24小时，再在透射光下分别观察苯唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐甲氧西林或耐万古霉素菌落的微弱生长。抑菌圈内的任何可见的生长，都表示甲氧西林或万古霉素耐药。

4.3判读标准抑菌圈边缘应是肉眼观察无明显生长的区域。如果在抑菌圈的边缘有微弱的小菌落生长，而且只有用放大镜才能看到，这些菌落就应该忽略。如果在透明的抑菌圈内有任何的单个菌落，都应进行二次培养，重新鉴定和重新试验。变形杆菌属的菌株可能会在某些抗微生物药的抑菌圈内蔓延生长。对于变形杆菌属，在本该十分明显的抑菌圈内的薄纱样蔓延生长，也应该忽略。对于甲氧苄啶和磺胺，培养基内的药物拮抗剂可能使细菌能微弱地生长，因此应忽略微弱的生长（生长的菌膜的20％或更少），并且应测量更为明显的边缘来决定抑菌圈的直径。用加血培养基测试链球菌时应测量生长受抑制的区域，而不是溶血受抑制的区域。

4.4抑菌圈大小的解释请参照NCCLS的报告方式，结果应报告细菌对被测药物敏感（S），中介（I）或耐药(R)。

参考文献

[1]倪语星.抗微生物药物敏感性试验规范[M],上海.上海科学技术出版社.2002.

[2]董亮、吴大玮、孙思华，等临床疗效及药敏试验研究[J]，中国全科医学，2004,7（7）:451.

[3]余修中，K-B法药敏试验中菌液量的规范[J],四川省卫生管理干部学院学报，2002.9（21）：177.178.

[4]王传新、王国礼，现代检验医学技术及质量控制[M]，济南，山东科学技术出版社，204:171.