大肠杆菌O157：H7检测方法的新进展

大肠杆菌O157：H7检测方法的新进展

张艳秋

张艳秋

（黑龙江省哈尔滨市木兰县疾病预防控制中心151900）

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）32-0049-02

大肠杆菌O157：H7是肠出血性大肠埃希菌(EHEC)血清型中极为重要的一组。美国是发生O157:H7型肠出血性大肠杆菌引发的食物中毒的第一个国家，此后，在加拿大、德国、英国、日本等多国由此种菌引发的食物中毒不断发生，由此菌产生的感染问题日益严重，因此对该菌的控制已成为世界性问题。寻求对EHEC快速、准确的检测方法是解决此问题的关键，因此大肠杆菌O157:H7检测方法的研究逐渐受到重视。

1细菌学分离法

细菌学分离法原理是采用培养基—山梨醇麦康凯琼脂，根据O157:H7绝大多数菌株不发酵山梨醇的特性进行分离。但是由于还有部分血清型的大肠杆菌O157和某些革兰氏阴性菌也存在不发酵山梨醇的特性，因此需要对此方法进行改良。其一，经加入鼠李糖和头孢克肟改进成为CRSMAC，可提高分离的敏感性；其二，作为一种单管筛选培养基，将H7抗血清加入SMAC半固体，检测EHECO157:H7。此方法检测EHECO157:H7的优点是简单、直观、成本低，但是由于发酵山梨醇的O157:H7变异菌株和非O157血清型的EHEC不能用山梨醇培养基分离，因此其最大缺点是敏感性和特异性都很差。

2免疫学方法

采用免疫学方法检测大肠杆菌O157：H7的方法较多，主要检测菌体抗原O157和鞭毛抗原H7，常见的有如下五种方法：

2.1血清凝集方法

血清凝集实验用来观察可疑菌与O157抗血清是否特异性凝集，目前为达到简便快速以及增强特异性的效果，采用凝集试验与分离培养方法结合进行的方式较多。此类方法因O157抗血清常与小肠结肠炎耶尔氏菌06血清型、厄班血清型、马耳他及其他血清型大肠杆菌O157等存在交叉反应，所以检测非O157血清型的EHEC不能应用此法。

2.2酶联免疫法(ELISA)

随着酶联免疫技术在微生物检验中的广泛应用，对于大肠杆菌O157：H7的检测，酶联免疫法逐渐成为常用方法之一，其原理是通过连接在磁珠上的抗体及碱性磷酸酶标记抗体实现待测细菌的双抗体夹心检测。在采用O157多抗的双抗夹心ELISA法与SMAC法的对比分析中显示ELISA法敏感度更高，并且ELISA法与沙门氏菌、志贺氏菌及弯曲菌均无交叉反应。因此酶联免疫法(ELISA)提高了大肠杆菌O157：H7检测的敏感性和特异性。

2.3免疫荧光法

免疫荧光法包括直接免疫荧光抗体染色和固相荧光毛细管免疫分析，前者应用荧光标记抗体染色直接检测EHEC，虽然检测耗用时间较短，但是特异性较差；后者若样品中含有EHECO157:H7，则与标记的抗体先结合，在检测生物素－亲和素-CY5结合物时，荧光发射强度减弱。

2.4免疫磁珠分离法

采免疫磁珠分离法检测大肠杆菌O157：H7，是以O157抗体包被磁珠，在捕获待检菌后，以磁场作用将磁珠分离，此法浓缩并纯化了待检菌液，从而大幅度提高了检测的灵敏度。目前已经发展使用纳米免疫磁珠技术，该技术是以抗体包被纳米磁珠的为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原－抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而达到分离目的[1]。此方法可在1小时同内完成菌体的分离和检测，并且检测限可达到10cfu／ml

2．5胶体金免疫技术

胶体金免疫法是以胶体金作为标记物应用于抗原抗体的免疫标记技术，分为斑点免疫层析法(DICA)和斑点金免疫渗滤法(DIGFA)两种。其中DICA利用的是免疫色层技术，在检测卡上，将胶体金标记的兔抗O157抗体和兔抗羊IgG抗体分别固定在膜上下，作为测试带和质控带。具有简便、快速定性作用[2]。免疫层析法(DICA)经常与免疫磁珠分离法结合，多用于EHECO157∶H7的初筛；而斑点金免疫渗滤法(DIGFA)是预先在硝酸纤维素膜的中央滴加纯化的抗O157∶H7抗体，待吸附干燥后，依次滴入待检菌液、胶体金标记O157∶H7抗体及洗涤液，以膜中央呈红色斑点者为阳性[3]。免疫胶体金法不需要特殊设备和试剂，且具有快速简便、稳定性、特异性及敏感性强、结果判断直观等特点，与ELISA相比较，灵敏度高，但特异度稍差。

3分子生物学检测方法

应用分子生物学检测大肠杆菌O157：H7主要采用DNA探针和PCR等方法。检测目前已经比较清楚的EHECO157:H7的毒力基因，如志贺样毒素基因slts、对上皮细胞粘附和抹平力基因eae、溶血素基因hly等。

3.1DNA探针方法

目前hly、sltl(VT1)、slt2(VT2)、eae和毒性质粒等可进行特异性杂交检测的基因探针已经制备，其中以CVD419质粒上314kb的Hind、酶切片段制备探针特异性较好。Huck筛选出O157大质粒上210kb的Sma1酶切片段VPM1标记作为探针，与所有ETEC和非大肠杆菌O157菌株均不杂交。

3.2PCR方法

大肠杆菌O157:H7检测中，PCR法是用来检测致病基因的最常用方法。随着PCR法从单一PCR发展为多重PCR后，在采用多重PCR法的实验中，PCR方法扩增eae、ehxA、stx1、stx2和saa基因，发现有几种或全部为致病基因。近年来，由于荧光定量PCR法的发展，大肠杆菌O157:H7的检测也开始采用这种技术，并且在实验中发现，荧光定量PCR法与ELISA及胶体金免疫法相比，其灵敏度、特异度和约登指数均高于其他两种方法。

3.3脉冲场凝胶电泳(PEGE)

脉冲场凝胶电泳主要用于基因组DNA的分析，PFGE标准化流程已由美国国家公共卫生实验室制定完成，在多次不同的O157:H7暴发流行中应用。目前已证明，PFGE在O157:H7的分子流行病学调查中是一种可靠的分型方法。但该法的缺点是结果不易分析，没有国际统一的标准，不易于在实验室之间进行比较，且仪器价格昂贵。

4其他检测技术

4.1基因芯片技术

基因芯片技术是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展，它具有高通量、微型化和自动化等特点，现已在O157:H7的诊断中得到了应用。该方法与普通凝胶电泳法相比，灵敏度增加了约30倍，可以检测小于1个细胞的基因组DNA的量的PCR扩增产物(1fg)[4]。

4.2生物传感技术

问生物传感技术的应用主要解决研制O157:H7快速检测试剂操作步骤繁多的题，问生物传感技术的应用主要解决研制O157:H7快速检测试剂操作步骤繁多的题，其中25g样品的检测灵敏度为9.0×103cfu/g，10g样品的灵敏度达到5.2×102cfu/g，在样品处理的25分钟内，没有假阳性结果出现，因此该方法灵敏度高，并且重复性较好，特异性也较为理想。

５小结

上述方法是在大肠杆菌O157：H7检测中的常用方法，但由于各种方法都存在缺陷和一定的局限性，因此在应用中受到限制，还需要随着未来相关检测技的不断发展，寻求更为优良的检测方法为临床的诊疗服务。

参考文献：

[1]侯楠楠，谌志，金敏等．基于功能化纳米粒子的大肠杆菌0157:H7检测技术研究[J]．环境与健康杂志，2010，7(5):410-412.

[2]庞惠勇，张玉玲，田锦萍，等.应用斑点免疫层析、免疫磁珠法快速分离大肠杆菌O157:H7[J].现代预防医学，2002，29(3):347-349.

[3]钟彦伟，汪力亚，周继文，等.建立斑点金免疫渗滤法检测O157:H7型肠出血性大肠杆菌[J].细胞与分子免疫学杂志，2000，16(1):83-84.

[4]史素云.大肠杆菌毒力因子研究进展[J].现代农业科技，2008，(19):271-272，274.