新型多靶点药物ZD1839对鼻咽癌细胞CNE2放射敏感性研究

新型多靶点药物ZD1839对鼻咽癌细胞CNE2放射敏感性研究

陈卫国袁亚维*

陈卫国袁亚维*（南方医科大学南方医院广东广州510515）

【摘要】目的:研究ZD1839对鼻咽癌细胞株CNE2放射增敏作用。方法:采用MTT法测定ZD1839的半数抑制浓度(IC50)，克隆形成实验计算细胞存活率,拟合生存曲线,流式细胞仪检测ZD1839联合放疗的凋亡率及细胞周期分布。结果:单药组，CNE2细胞的存活率ZD1839浓度的增加而降低，其IC50约为2.26μmol/L。联合组，ZD1839作用CNE2细胞24h后均见到放射增敏作用，增敏比为1.529±0.135。ZD1839或照射均可增加凋亡率,减少S期细胞比例及增加G2/M期细胞比例(P<0.01)。结论:ZD1839联合电离辐射可提高鼻咽癌细胞的放射敏感性，其机制之一可能是ZD1839促进细胞凋亡、干扰细胞周期分布及下调Bcl-2蛋白表达。

【关键词】鼻咽癌；CNE2细胞株；ZD1839；放射增敏作用

【中图分类号】R739.63【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2010）10-0213-02

鼻咽癌病理类型以低分化鳞状细胞癌多见，临床治疗以放疗为主，晚期患者辅以化疗。ZD1839（商品名为Iressa）是一种新开发的可供口服的选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，其通过小分子化合物竞争结合EGFR酪氨酸激酶催化区的Mg-ATP结合位点，抑制酪氨酸激酶活性，阻断激酶及其底物的磷酸化，彻底阻断异常的酪氨酸激酶的信号转导通路，来达到抗肿瘤目的［1］。研究发现对鼻咽癌细胞株CNE2细胞具有明显的抑制作用［2］，但对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响如何？有关报道尚不多见，本实验将ZD1839联合放疗应用于鼻咽癌细胞株CNE2细胞，通过克隆形成实验、流式细胞分析等观察ZD1839的放射增敏作用及其可能机制，以期为临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料:ZD1839由英国阿斯利康（AstraZeneca）公司提供，MTT及碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品,用PBS液配制成5mg／mL的溶液。AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂，二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma公司，RPMIMedium1640为Gibco公司产品。

1.2细胞系及培养:鼻咽癌细胞系CNE2由我院肿瘤中心实验室提供；细胞培养在含10%小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的PRIM1640培养液中，置37℃、5%CO2的恒温箱中培养。取对数生长期细胞进行实验。

1.3四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测IC50:细胞消化、计数,按每孔0.5×105细胞均匀接种于96孔培养板,24h细胞贴壁后,将10倍稀释、不同浓度的ZD6474分别加入各孔内,每浓度设5个复孔,并设不加药的细胞对照和空白对照。药物作用72h后,每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL,继续孵育4h终止培养,1500r/min离心10min后弃上清,用DMSO150μl溶解沉淀,550nm波长测量吸光度,计算细胞抑制率。抑制率=100％×[对照组吸光值(A)一实验组吸光值(A)]／对照组吸光值(A),计算半数抑制浓度(IC50)，实验重复3次,计算IC50平均值。

1.4克隆形成实验测ZD1839对CNE2细胞的放射增敏作用实验分为3组，①对照组；②照射组(2Gy)；③ZD1839组；④联合照射组。贴壁培养24h。吸出培养液,用药组分别加入终末浓度为IC50的ZD1839的培养基5mL，单纯照射组只加入培养基5mL，继续培养24h。然后立即除去药物,用PBS洗2次。单纯照射组和照射加药组均分别进行照射,照射后置于37℃、5%CO2培养箱内与其他组一起继续培养12d。细胞用100%纯甲醇固定后,吉姆萨染色,并计数。

集落形成率(%)=阴性对照组计数的集落数/细胞接种数×100%

SF(%)=计数的集落数/种植的细胞数×集落形成率(%)

计算机进行统计学处理，用单击多靶数学模型进行曲线拟合做图，求曲线参数D0、Dq、N值。最后求放射增敏比(SER)，公式如下：SER=单纯照射组D0值比药物+照射组D0值。

1.5流式细胞分析

1.5.1实验分组:将增殖良好并处于对数生长期的CNE2细胞制成细胞悬液，随机分成4组：（1）空白对照组：单纯培养液培养24h；（2）药物治疗组：加含100μmol/LZD1839；（3）照射治疗组：照射6Gy；（4）联合治疗组：加入含100μmol/LZD1839后；再照射6Gy。

1.5.2PI分析细胞周期:收集不同组细胞，70%冷乙醇固定过夜，RnaseA37℃水浴消化30min，PI避光染色30min，上流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.6统计学处理:采取多靶单击模型拟合细胞存活曲线,并计算出D0。SER的定义为达到相同的生物效应时,单纯照射的剂量与照射加药组的剂量之比。根据D0值计算出SER。实验设3个平行样,重复实验3次,结果取平均值，使用SPSS13.0统计软件包,ZD1839及放射效应的比较采用方差分析,P<0.05认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1MTT实验ZD1839对CNE2细胞的放射增敏作用见（图1）。

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图1按线性二次方程拟合的细胞存活曲线2.2不同处理对细胞周期的影响,见表1。

表2不同处理组CNE2细胞的周期分布（%，X±S，n=3）

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﹡VS对照组,P<0.05；﹟VS照射组，P<0.05；△VSZD1839组，P<0.05

2.3流式细胞术分析细胞细胞凋亡情况(见表2)。

表2照射、ZD1839联合照射对CNE2细胞凋亡的影响(%，X±S)

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3讨论

鼻咽癌的临床治疗以放疗为主，化疗为辅，但大多数化疗药物的毒副作用较强，放疗效果不令人满意。由于EGFR在肿瘤细胞中的生物学活性，ZD1839已经成为新的抗肿瘤治疗的靶点，Shintani等的研究发现，ZD1839和放射联合降低了DNA修复酶DNA-PKc、Ku70和Ku86在HSC2和HSC3细胞核中的表达［3］，从而使肿瘤细胞DNA分子的修复能力受到抑制，提高了放射的敏感性。C225(西妥昔单抗)联合放射能诱导细胞更多地堆积在放射敏感的G2/M期和相对敏感的G1期，而S期细胞的比例减少，从而显著提高了肿瘤的放射敏感性［4］。Nasu等将EGFR高表达的A431细胞分为单独单次照射和单次照射与C225联合，结果发现，应用C225显著降低了肿瘤控制剂量(50%)，显示C225对致克隆细胞具有直接的细胞毒作用［5］。但令人遗憾的是目前对EGFR阻断剂是否具有直接的细胞毒作用和诱导肿瘤细胞凋亡作用还有争议，众多的实验并未发现EGFR阻断剂的直接细胞毒作用［6］。尽管没有资料显示EGFR阻断剂对放射抗拒的乏氧细胞的作用和促使放疗期间乏氧细胞再氧化作用，但有证据表明，EGFR阻断剂能抑制肿瘤血管生成。免疫组织化学显示，与单用C225或单纯放射相比，C225与放射联合可显著降低促血管生成因子VEGF的表达，从而明显地抑制了肿瘤的血管生成［7］，同样，ZD1839能阻止管道系统的形成并使细胞失去细胞与细胞间的连接,从而抑制肿瘤的血管生成［8］。

ZD1839是一种选择性的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，可以通过阻断信号传导途径而抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤血管生成，相关研究已经证实ZD1839对多种肿瘤均有抗肿瘤活性，而且不论是间断给药还是持续给药，都具有很好的耐受性［9］。Bianco等［10］采用人结肠癌、卵巢癌细胞株,分别作用于表皮生长因子抑制剂和/或射线,也证实了此类药物与放疗联用时,凋亡率显著增高,放疗耐受的S期细胞比例显著下降。

本研究中克隆形成实验结果显示，ZD1839联合放射后较单纯放射后D0和Dq值减小。其中D0下降表示CNE2细胞对放射的敏感性上升；Dq降低反映杀伤CNE2细胞的阈剂量变小。故加入一定浓度的ZD1839，可使放射剂量减少，从而产生一定的放射增敏作用。

本研究中流式细胞分析显示，与单纯药物治疗组和单纯照射治疗组比较，两者联合应用后G2/M期比例增加(P＜0.05)。虽然G2/M期比例越高，越有利于肿瘤细胞DNA损伤的修复，使部分亚致死性细胞和潜在致死性细胞恢复正常以避免凋亡，但是G2/M期较其他期对放射线敏感。

总之，ZD1839对CNE2细胞具有放射增敏性具有一致性，其放射增敏的机制可能与促进细胞凋亡、干扰细胞周期分布及下调Bcl-2蛋白表达有关。

参考文献

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［3］ShintaniS,LiC,MiharaM,etal.Enhancementoftumorradioresponsebycombinedtreatmentwithgefitinib(Iressa,ZD1839)，anepidermalgrowthfactorrecptortyrosinekinaseinhibitor,isaccompaniedbyinhibitionofDNAdamagerepairandcellgrowthinoralcancer[J].IntJCancer,2003,107:1030-1037

［4］HuangSM,HarariPM.Modulationofradiationresponseafterepidermalgrowthfactorreceptorblockadeinsquamouscellcarcinomas:inhibitionofdamagerepair,cellcyclekineticsandtumorangiogenesis[J].ClinCancerRes,2000,6:2166-2174

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［6］SolomonBM,HagekyriakouJ,TrivettMK,etal.EGFRblockadewithZD1839(Iressa)potentiatestheantitumoreffectsofsingleandmultiplefractionsofionizingradiationinhumanA431squamouscellcarcinoma[J].IntJRadiatOncolBiolPhys,2003,55:713-723

［7］HuangSM,HarariPM.Modulationofradiationresponseafterepidermalgrowthfactorreceptorblockadeinsquamouscellcarcinomas:inhibitionofdamagerepair,cellcyclekinetics,andtumorangiogenesis[J].ClinCancerRes,2002,6:2166-2174