红景天苷通过下调肝组织TLR4的表达抑制肝纤维化

红景天苷通过下调肝组织TLR4的表达抑制肝纤维化

刘静杨小李黄丽胡晓松

1.四川省遂宁市中心医院普通外科，2.肝胆外科四川遂宁629000；

3.四川省绵阳市第三人民医院消化内科四川绵阳621000；4.成都医学院形态学教研室四川成都610083

摘要：目的：探讨红景天苷对大鼠肝纤维化的抑制作用及其作用机制。方法：选清洁级雄性SD大鼠，随机分为3组：NS对照组（n=12），红景天甙干预组（n=12）和肝纤维化模型组（n=12）。NS对照组自由进食和饮水，不进行任何干预，余下2组进采用CCl4皮下注射法诱导大鼠肝纤维化模型。干预组在诱导中期加入红景天苷，肝纤维化模型组继续原诱导方案，诱导12周结束后取肝组织进行H&E染色、MASSON染色观察肝纤维化情况，免疫组化及Western检测肝组织TLR4表达情况。结果：干预组12只大鼠同样全部发生肝纤维化，但肝纤维化程度低于模型组；肝组织HE染色显示：CCl4使大鼠肝脏结构破坏明显，胶原纤维显著增生；红景天甙干预组肝脏病理损害较轻微；MASSON染色结果显示：正常肝组织仅于中央静脉周围显示少量蓝色纤维，红景天甙干预组大鼠肝脏胶原面积减少，干预组CVF%为1.642±0.616%，虽然高于NS组，但明显低于模型组，差异有统计学意义；免疫组化及Western结果显示红景天苷组肝组织TLR4表达明显低于模型组。结论：红景天苷能够通过下调TLR4的表达，明显减轻大鼠的肝纤维化程度，对大鼠肝纤维化进程有一定的保护作用。

关键词：肝纤维化；红景天苷；TLR4

[Abstract]Objective：Thestudyaimedatevaluatingtheanti-fibrosiseffectsofsalidrosideandexploringthepossiblemechanism.Methods：Fifty-fourSDratswereequallyrandomizedintothecontrolgroup（n=12），salidrosidegroup（n=12）andfibrosismodelgroup（n=12）.Ratincontrolgroupreceivednointervention.liverfibrosiswasinducedbyCCL4hypodermicinjectioninsalidrosideandfibrosismodelgroup.Intraperitonealinjectionofsalidrosidetwiceaweekwasadministratedinthesalidrosidegroup8weekslater.HEandMassonstainingwereobservedunderlightmicroscope.TLR4expressionwadanalysedbyimmunohistochemicalandwesternblot.Result：allratsgotliverfibrosisinsalidrosideandfibrosismodelgroup，butthefirbosisdegreeinsalidrosidegroupwasmuchlowerthanfibrosismodelgroup.HEstainingshowedthat：chronicsubcutaneousinjectionofCCL4couldleadseverepathologicaldamagesinrats’liverandexcessivercollagendepositionwasobserved.Pathologicalchangeismildinsalidrosidegroup，whilesevereinthefibrosismodelgroup.·Massonstaining.theaverageareaofcollagenfiberwasreducedinsalidrosidegroup.TheCVF%insalidrosidegroupwas1.642±0.616%，muchlowerthanfibrosismodelgroup，Differencewasstatisticallysignificant；TLR4expressioninsalidrosidegroupwaslowerthanfibrosismodelgroup.Conclusion：salidrosideintraperitonealinjectioncanrelievethehistologicaldamageinratliver.ThepossiblemechanismmaylinkedtoreduceTLR4expression。

[Keywords]liverfibrosis；salidroside；TLR4

肝纤维化是多种肝病进展为肝硬化、肝癌的必经阶段，如何有效的逆转或抑制肝纤维进展一直是肝病防治的重点。红景天苷是红景天全草或根茎的主要生物活性成分之一，化学名称为2-（4-羟基苯基）乙基-β-D-葡萄糖苷，化学分子式为C14H20O7，相对分子质量为300.3，为类白色或浅黄色针状结晶，是一种苯乙醇类化合物。主要药理作用有中枢兴奋、抗疲劳、强心、抗炎、抗过氧化、抗微波辐射、降血糖等[1]。研究发现，红景天苷能够减轻实验小鼠的肝纤维化程度[2，3]，但很少有对红景天苷抗纤维化作用机制的研究。进一步研究红景天苷抗肝纤维化的作用机制，对推进抗肝纤维化的药物研究具有重要意义。TLR4在肝脏中分布于多种细胞如kupffer细胞、肝实质细胞、肝星状细胞等。多种病原相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）均可与TLR4相互作用，激活Kupffer细胞和肝星状细胞，导致肝损伤和肝纤维化，研究表明TLR4信号通路在肝硬化、肝癌的发病机制中扮演着十分重要作用[4]。本实验采用红景天苷对CCl4诱导的肝纤维化大鼠进行干预，观察大鼠肝纤维化程度变化，通过检测TLR4的表达，探讨红景天甙抗纤维化的作用机制。

1材料与方法

1.1动物与试剂：选用清洁级SD雄性大鼠36只，体重200-240g，平均220g，由成都医学院动物实验中心提供。随机分为3组：NS对照组（NS组）、红景天甙干预组（干预组）和肝纤维化模型组（模型组），每组12只，大鼠饲养于成都医学院IVC级实验动物房。红景天苷由西安艾沃生物科技有限公司提供。CCl4由济南嘉裕化工有限公司提供。Masson染色试剂盒由SIGMA-ALORICH提供。TLR4蛋白一抗购自美国UCL公司。

1.2模型的构建：NS对照组大属进行自由进食和饮水，不进行任何干预。模型组采用CCl4皮下注射法（300mL/L，3mL/kg，每周2次，共8w诱导大鼠肝纤维化。干预组在模型组建模方法基础之上，给予红景天甙（100g/L）采用腹腔注射法，剂量5mg/kg，每周2次，共8周。

1.3HE及染色：各组肝脏组织HE染色取相同部位肝叶组织，10%甲醛充分固定，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察肝脏组织形态学变化。免疫组化及WEstern检测TLR4的表达水平。Masson三色染色：取相同部位肝叶组织，肝脏Bouin's液固定后，石蜡包埋、切片，MASSON试剂盒进行染色，胶原纤维被染成蓝色，光镜下观察肝脏组织形态学变化。在显微镜下20X视野采图，每个样本随机采集5个视野，使用图像分析系统测得肝胶原面积及视野总面积，计算肝胶原容积百分比（CVF），计算方法：CVF=胶原面积/总面积X100%。

肝纤维化分级标准：0级，无胶原纤维增生；I级，肝汇管区扩大，但未形成间隔；II级，肝汇管区扩大，有小的间隔形成；III级，间隔很多，少量假小叶形成，不完全肝硬化；Iv级：大量假小叶形成，完全肝硬化。

1.4统计学处理：采用SPSS17.0统计软件进行数据的分析处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠肝纤维化程度观察结果：模型组12只大鼠全部发生肝纤维化，8只发生4级肝纤维化，4只发生3级肝纤维化；干预组12只大鼠同样全部发生肝纤维化，但肝纤维化程度低于模型组；NS组无1只大鼠发生肝纤维化。

2.2肝脏组织学变化与胶原沉积HE：CCl4使大鼠肝脏结构破坏明显，肝细胞脂肪变性、坏死，间质炎性细胞浸润，胶原纤维显著增生；红景天甙干预性治疗组肝脏病理损害较轻微（图1）。MASSON染色结果：正常肝组织仅于中央静脉周围显示少量蓝色纤维，为中央静脉的结缔组织着色，肝细胞索显示为铁锈红色，显色对比鲜明，红景天甙干预组大鼠肝脏胶原面积减少（图2）。干预组CVF%为1.642±0.616%，虽然高于NS组0.154±0.067%，但明显低于模型组2.752±0.933%，差异有统计学意义。

2.3TLR4表达情况：免疫组化显示，模型组大鼠肝小叶内可见大量TLR4表达（图3），而干预组大鼠肝小叶内仅出现少量TLR4表达。Western结果显示干预组TLR4表达明显低于模型组。

3讨论

结果显示，红景天苷可减轻CCL4诱导的大鼠肝纤维化程度，减少细胞外胶原沉积，并可明显减少TLR4的表达。红景天苷是红景天全草或根茎的主要生物活性成分之一，具有多种生理作用[1]。研究发现，红景天苷能够减轻实验小鼠的肝纤维化程度，对大、小鼠肝纤维化进程均有一定的保护作用[2，3，5]。我们的研究结果与之相似，红景天苷干预的大鼠肝纤维化程度减轻，肝脏胶原沉积明显少于模型组，进一步验证了红景天苷在减轻肝纤维化中的作用。目前对红景天苷抗肝纤维化的作用机制的研究尚欠深入，肝纤维化细胞分子机制复杂，TGF-β1最强的促纤维化细胞因子[6]，可由激活的肝内巨噬细胞分泌，作用于HSC，使HSC激活，活化的HSC直接合成细胞外胶原；同时分泌TIMPs，抑制细胞外基质中胶原分解，最终导致肝纤维化[7，8]。吴晓玲等研究发现，红景天甙的抗肝纤维化作用与抑制TGF-β1的表达有关[2]，郭丰成等的研究发现，在红景天苷干预的小鼠肝脏，F4-80标记的巨噬细胞百分比明显低于模型组，认为红景天苷可能是通过抑制巨噬细胞增殖或促进凋亡起抗肝纤维化作用[3]。而TLR4是TGF-β1和肝内巨噬细胞表型变化共同的上游信号分子，广泛表达于肝组织，是一种重要的模式识别受体，可与多种相关分子模式结合激活Kupffer细胞和肝星状细胞，分泌大量促炎因子和促纤维化因子，在肝脏炎症和纤维化过程中起了关键作用[9，10]。我们发现红景天苷可降低肝组织TLR4受体的表达，对红景天苷的抗纤维化药理机制做了重要的补充。但红景天苷抑制TLR4的分子信号通路的具体作用环节尚有待深入的研究。综上，红景天苷能够减轻大鼠的肝纤维化程度，此作用的发挥可能是该药物影响了肝脏中TLR4的表达有关。

参考文献：

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[2]吴晓玲，曾维政，蒋明德等.红景天甙对肝纤维化大鼠肝组织ROCK表达的影响[J].世界华人消化杂志，2009，17（8）：765-769.DOI：10.3969/j.issn.1009-3079.2009.08.005.

[3]郭丰成，历志，金超等.红景天苷干预小鼠肝纤维化的研究[J].现代生物医学进展，2013，13（15）：2825-2828.

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