蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤MMP-9、MMP-2、EB含量的影响

蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤MMP-9、MMP-2、EB含量的影响

叶丽莎白雪杨思进

西南医科大学附属中医医院四川泸州646000

蛭龙活血通瘀胶囊系由黄芪、水蛭、地龙、大血藤等组成的复方制剂，具有益气活血化瘀通络的功效，临床用于急性缺血性脑病。从脑缺血再灌注损伤的病理机制来说，“脑保护”应包括减轻炎症损伤、消除脑水肿、阻止神经细胞凋亡坏死等环节。本实验根据缺血性中风的病机特点，研究蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤中MMP-2、MMP-9、EB含量的影响，以进一步明确脑缺血再灌注损伤与中医病机的关系，并探讨蛭龙活血通瘀胶囊防治脑缺血再灌注损伤的部分作用机制。

材料与方法

1.动物分组健康雄性成年SD大鼠，体重（250-300）g，清洁级，由西南医科大学动物实验中心提供。选用雄性成年SD大鼠175只，随机分成4组：假手术组，对照组（步长脑心通组），模型组即脑缺血再灌注组（I/R组），蛭龙活血通瘀胶囊组。模型组和蛭龙组、对照组又分为I/R3h、6h、24h、48h、72h5个亚组，蛭龙组每个时间点又分为低、高剂量组。

2.药物干预：蛭龙活血通瘀胶囊成人的临床用药量为4.8g/d。按人体用量的5、20倍，换算为动物高、低剂量组的用药量，分别为1.6g/kg/d、0.4g/kg/d；对照组按成人用量的10倍给药，即0.8g/kg/d。假手术组及模型组以等体积生理盐水灌胃，每天一次，共2周。给药组给药方法为模型制备前2周予以灌胃，每隔24h灌胃给药1次，然后制备大脑中动脉缺血再灌注模型。各组于术后3h、6h、12h、24h、48h、72h组分批次处死动物，收集脑组织标本及血清进行检测。

3.模型制备：参照ZeaLongaEL等腔内线栓法。假手术组除插线深度为10mm外，其余处理同模型组。在麻醉动物清醒后6h进行评分。动物评分在1～3分之间的认为造模成功，纳入实验。逐日观察动物的体态、活动、神经功能缺损体征及动物的其它一般情况。

4.标本处理

4.1EB含量测定各时间点处死动物，进行EB含量测定：各组动物在处死前2h按20mg/kg自股静脉注入2%的EB溶液，缺血侧标本取出后加甲酰胺3ml，避光，在54℃水浴箱中提取24h，在自外分光光度计下、波长为632nm处测量提取液吸光度（A）值，以脑组织EB含量（μg/g）代表血脑屏障通透性。

4.2免疫组化法分析MMP-2和MMP-9的活性变化大鼠过量麻醉致死后，迅速断头，冰浴中取脑。PBS裂解缺血侧脑组织蛋白，匀浆离心、测定蛋白浓度；检测方法严格按试剂盒提供的说明书进行。试剂盒采用双抗体夹心法原理。

5统计学方法采用SPSS13.0软件进行数据分析。所有数据均采用x±s表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析和Bonferroni检验，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.EB含量测定见表1。结果表明：模型组EB含量在3h开始升高，48h达到高峰，以后开始下降。蛭龙组及对照组在各时间点的EB含量较模型组均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。各时间点的EB含量在低、高剂量组中逐渐下降，剂量越高EB含量越低，组间差异有统计学意义（P<0.05）。

表1各组大鼠EB含量比较

2.免疫组化法检测MMP-2和MMP-9的活性变化

2.1蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑组织MMP-2活性表达的影响见表2。假手术组

MMP-2阳性表达数在缺血再灌注24h开始增加显著，48h继续显著增加。模型组与假手术组相比，在再灌注不同时间点MMP-2阳性表达均增高（P<0.05）；蛭龙组与对照组在再灌注不同时间点MMP-2阳性细胞数的表达均降低（P<0.05），但高于假手术组（P<0.05）。如表2。

表2各组大鼠不同时间点MMP-2阳性细胞数的表达

2.2蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑组织MMP-9活性表达的影响见表3。假手术组大鼠脑组织有MMP-9低表达，模型组3h表达开始升高，至48h达高峰，72h表达下降。蛭龙组及对照组MMP-9表达活性在同一时间点相比明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。

表3各组大鼠不同时间点MMP-9阳性细胞数的表达

讨论

大量研究证实，大脑缺血再灌注损伤是一个复杂的、多因素参与的过程，蛋白酶和自由基是导致缺血再灌注损伤的主要因子，MMP-9，MMP-2与缺血性脑血管病的关系日益成为研究的热点。脑缺血再灌注后，由于能量代谢障碍、自由基大量产生、炎症介质的生成等都能够促进MMP-9和MMP-2表达上调，造成血管内皮损伤、通透性增加，血浆蛋白等物质进入周围脑组织中，导致血管源性脑水肿，加重脑损伤[1]。

在中医基础理论指导下，我们提出了对缺血性中风采用“重用补气，辅以化淤通络”的治疗方法。在此法则指导下形成的“蛭龙活血通瘀胶囊”，已在临床运用十余年且疗效确切。“蛭龙活血通瘀胶囊”组方为：黄芪、人参、水蛭、大血藤、桂枝等药。现代研究表明[2]，水蛭素可增加脑血流量，促进大鼠实验性脑血肿的吸收，减轻血肿周围炎性反应性水肿，改善局部血液循环，保护脑组织。董少龙等[3]研究结果表明，水蛭注射液可改善大鼠脑缺血再灌注损伤的神经功能缺失，减少脑梗死面积。近年来研究证实，黄芪的有效成分具有清除氧自由基、减轻脑组织过氧化损伤和迟发性神经原损害的作用。本研究发现脑组织EB含量在缺血再灌注后逐渐升高，48h达到高峰，与MMP-9在脑内的活性表达规律相同。同时发现蛭龙活血通瘀胶囊能通过调控局灶性脑缺血再灌注大鼠MMP-2、MMP-9及EB的含量，减轻血管源性脑水肿，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，从而为中医中药临床治疗脑梗死提供新的治疗方法，也进一步显示了中药复方制剂在治疗脑血管疾病中的潜力。

参考文献：

[1]TurnerR，VinkR.Inhibitionofneurogenicinflammationasanoveltreatmentforischemicstroke.DrugNewsPerspect，2007，20（4）：221-226

[2]蒋洪，刘乐乐，等.中药红藤化学成份及临床作用的研究进展[J].内蒙古科技与经济，2002，10（3）：120-121

[3]赵正兰.梗死的血液流变学研究及临床应用[J].临床荟萃，1994，9（17）：800-801