微囊藻毒素的荧光定量PCR检测法

微囊藻毒素的荧光定量PCR检测法

黄宗耀

深圳市深水龙华水务有限公司

摘要：荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、精确度高、检测范围宽、重复性好优势，本文就其方法对水体中的微囊藻进行检测。

关键词：荧光定量PCR；微囊藻毒素；检测

随着我国工农业的迅猛发展以及城市化进程的加快，生活污水、工业废水中污染物的排放量日益增加，环境污染越来越严重，造成水体富营养化及污染日益严重。水中过量的氮、磷等营养性物质，使水中蓝藻等藻类过渡繁殖，蓝藻水华暴发频繁。藻类水华爆发严重威胁城市水源水安全。因此，及时监测城市源水蓝藻发生情况，对保证城市供水安全具有重要意义。

蓝藻监测，传统的方法主要通过显微镜镜检法，对水体中的藻细胞计数及分类，后来又有通过藻类的16SrDNA序列分析进行藻种分类，然而这些方法不能区分产毒微囊藻及非产毒微囊藻，并在蓝藻暴发之前对其进行准确预测。实时荧光定量PCR（Real-timefluorescencequantitativePCR，qPCR）方法是一种特异性强、敏感性高、准确性好的分子检测方法，已被用于产毒微囊藻的监测。微囊藻毒素由一些藻毒素合成酶基因簇控制，该基因簇由mcyA～mcyJ等10个基因构成。通过检测微囊藻毒素的产毒基因mcyAmcyBmcyD可以用于监测水体中的产毒微囊藻细胞。mcyE基因可以用于设计种特异性引物，用于监测水体中的产生微囊藻毒素的不同产毒藻种。Ouahid等利用mcyE等藻毒素合成酶基因监测水体中的产毒微囊藻［5］。Al-Tebrineh等利用mcyE和ndaF基因设计的实时荧光定量PCR方法，同时监测水体中的不同微囊藻毒素产毒藻种［3］。由于不同水域环境中水体的产毒微囊藻的种类及分布不同，本文利用荧光定量PCR技术，对水体中的微囊藻进行检测。

1材料与方法

1.1藻种来源和培养条件

实验用藻种购买于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，藻种编号为鱼腥藻（Anabaenasp）FACHB-82水华束丝藻（Aphanizomenonflos-aque）FACHB-1039铜绿微囊藻FACHB-315柱胞鱼腥藻（Ana-baenacylindrica）FACHB-170席藻（Phormidiumsp.）FACHB-1099水华束丝藻FACHB-245颤藻（Oscillatoriasp．）FACHB-1053，于BG-11培养基中扩大培养，颤藻FACHB-528在SE培养基中扩大培养。培养温度为25℃，光照强度为30E/（m2s），光暗比12h∶12h。

1.2藻细胞基因组DNA的提取

1.2.1基因组DNA提取分别采用2种方法提取藻细胞基因组DNA：方法1按植物基因组DNA提取试剂盒（SK8203，上海生工）的操作程序，提取藻细胞基因组DNA.取藻液10ml，12000转/min离心15min，弃上清，取沉淀用于基因组DNA提取；方法2基因组DNA的快速提取。

1.2.2DNA浓度与纯度检测分别取藻类基因组的DNA各5l，加入495lTE缓冲液稀释，用微量核酸蛋白测定仪（BeckmancoulterDU-530，美国）测定DNA浓度，测定A260和A280，DNA浓度计算公式为：［DNA］=A260×稀释倍数100×40g/ml。

1.3PCR引物设计与PCR扩增

根据mcyE和ndaF基因设计普通PCR和荧光定量PCR引物，具体参考文献［3］，引物序列见表1。16SrDNA和mcyE/ndaF基因的PCR反应体系：10mol/L引物-F1l，10mol/L引物-R1l，10×PCRbuffer2l，10mol/LdNTP2l，25mmol/LMgCl21.5l，模版DNA1l，Tag酶（5U/l）0.5l，ddH2O17l，总体积25l，PCR反应条件如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，退火温度分别为50℃和56℃，30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃，5min。将PCR产物在3%琼脂糖凝胶进行电泳．

表1普通PCR和荧光定量PCR扩增引物

1.4荧光定量PCR

在Bio-radCFX3700仪器上进行荧光定量PCR扩增，PCR反应体系：Hotstartfluo-PCRmix（SK2956A，上海生工）10l，10mol/Lcyano-realmcyE-F05l，10mol/Lcyano-realmcyE-R0.5l，0.1%（w/v）BSA2l，10%（w/v）PVP-302l，模版DNA1l，ddH2O4l，总体积20l，PCR反应条件如下：95℃预变性10min，95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，退火过程中收集荧光，每个样品重复3次。熔解曲线的过程：95℃15s，从60℃开始升高至95℃，每30s温度升高0.5℃，进行熔解曲线分析。

1.5特异性检测

提取不同藻种基因组DNA，进行普通PCR扩增和荧光定量PCR扩增，并以16SrDNA为对照，检测引物的特异性。

1.6荧光定量PCR标准曲线建立

分别以铜绿微囊藻FACHB-315基因组DNA进行10倍稀释，测定DNA浓度，以基因拷贝数的对数值与反应循环数（Ct）值之间建立标准曲线.基因拷贝数的计算公式为：DNA的拷贝数=6.02×1023（copies/mol）×DNA浓度（g/l）/基因组DNA分子量，微囊藻基因组为4.70Mb，1bp碱基分子量为660g/mol．扩增效率E=10－1/S－1，S为标准曲线线性方程的斜率。

1.7环境样品检测

在湖口的7个监测点进行采样，水温26℃。用采水器采集表层20cm水样，每升水样加15ml左右鲁哥试剂。1000ml水样直接静置沉淀24h，用虹吸管小心抽掉上清液，余下20～25ml沉淀物转入50ml离心管中，4℃保存，带回实验室后利用显微镜镜检法进行藻细胞检测。用0.45m滤膜过滤收集藻细胞，置于－20℃条件下保存水样和藻细胞。按基因组DNA快速提取法提取DNA，并进行荧光定量PCR，检测样品中产毒微囊藻，每个样品重复3次。

2结果与分析

2.1引物特异性检测

提取不同产毒藻种的基因组DNA进行微囊藻毒素产毒基因mcyE/ndaF和16SrDNA基因PCR扩增，其中铜绿微囊藻FACHB-315为微囊藻毒素产毒藻种，鱼腥藻FACHB-82颤藻FACHB-528水华束丝藻FACHB-245颤藻FACHB-1053席藻FACHB-1099为鱼腥藻毒素产毒藻种，柱胞鱼腥藻FACHB-1039为柱胞藻毒素产毒藻种，仅在微囊藻毒素产毒藻种铜绿微囊藻FACHB-315扩增出125bp左右目标条带，其他产毒藻种未扩增出目标条带，说明引物特异性较好；所有藻种的16SrDNA基因均扩增出80bp左右的目标条带，表明藻种基因组DNA提取及PCR扩增体系无问题。对这些产毒藻种的荧光定量PCR结果表明，只有其中铜绿微囊藻FACHB-315有荧光检测信号，其余藻种均未能扩增出信号。

2.2荧光定量PCR灵敏度与重复性

2.2.1标准曲线的建立以铜绿微囊藻FACHB-315基因组DNA10倍梯度稀释后作为荧光定量PCR模版DNA，进行qPCR测定。以标准品稀释后浓度的对数值为横坐标Ct为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线，结果见图1。利用该qPCR反应条件检测微囊藻毒素产毒藻种，标准曲线斜率为－3.454，R2=0.991，扩增效率E=101/3.454－1=94.6%，定量检测区间为1.689×104～1.689×108拷贝数/l。

图1mcyE/ndaF基因实时荧光定量PCR标准曲线

（A：实时荧光定量PCR曲线；B：标准曲线）

2.2.2熔解曲线以铜绿微囊藻FACHB-315基因组DN为模板进行荧光定量PCR，并进行熔解曲线分析，熔解曲线平稳，峰尖且窄，熔解温度为80±0.5℃，表明该PCR扩增产物特异，无非特异性扩增。

2.2.3重复性将不同浓度的铜绿微囊藻

FACHB-315基因组DNA进行荧光定量PCR测定，结果如表2所示.基因组标准品的循环数变异系数分别为0～5.62%，表明基因组DNA的标准曲线稳定性良好，符合制备实时荧光定量PCR标准曲线的要求.

2.3全细胞荧光定量PCR检测

将铜绿微囊藻FACHB-315藻细胞进行10倍系列稀释，分别取1ml藻样，提取基因组DNA，进行qPCR，结果如表3，可检测的藻细胞浓度最低为3.26×104，mcyE/ndaF基因拷贝数为5.415×105，藻细胞浓度与mcyE/ndaF基因的相关性良好（图1），可以根据样品中mcyE/ndaF基因拷贝数，利用y=－3.454+49.88方程推测藻细胞浓度。

表2荧光定量PCR重复性检测

表3全细胞荧光定量PCR检测

3讨论

在蓝藻水华暴发影响水质安全之前，快速准确地对产毒微囊藻进行监控是非常重要的。传统监测方法不能区分蓝藻水华中的产毒微囊藻与非产毒微囊藻.以微囊藻毒素产毒和节球藻毒素基因mcyE/ndaF为靶基因，应用实时荧光定量PCR方法可以快速准确的检测水体中的产毒微囊藻，可以同时检测多种产微囊藻毒素和节球藻素的不同藻种细胞，特异性强，灵敏度高、准确性好［3-4］。本研究以微囊藻属、鱼腥藻属、柱孢藻属等8种不同藻种，以mcyE/ndaF为靶基因进行常规PCR和荧光定量PCR检测，表明引物特异性非常高。该结果与Al-Tebrineh等［3］的研究结果一致。

通过对产毒微囊藻铜绿微囊藻FACHB-315进行灵敏度和重复性检测，发现利用qPCR对铜绿微囊藻的范围为1.689×104～1.689×108拷贝数/l，灵敏度低于Vaitomaa等的报道［7］，其对于铜绿微囊藻的检测范围为6.6×102～6.6×106mcyE基因拷贝/反应体系，可能与藻基因组提取质量有关。本研究采用了一种DNA快速提取方法，该方法可以高效快速地提取藻细胞DNA，整个过程仅需20min，DNA提取质量经检测，纯度未达到A260/A280大于1.8，但可以用于高通量的普通PCR反应和荧光定量PCR反应。在荧光定量PCR反应中需加入2种试剂，即聚烙吡咯烷酮（PVP-30）和牛血清蛋白BSA，该试剂可以显著增强反应的灵敏度，降低反应对于模版质量的要求，与Xin等［6］的研究结果一致，对于高通量的荧光定量PCR反应十分重要。

通过荧光定量PCR技术检测蓝藻水华高发季节，产毒微囊藻的数量，研究结果表明，产毒微囊藻主要由铜绿微囊藻构成。该方法可以快速准确地对产毒微囊藻进行监测预警，对于保证该区域的饮用水安全及了解湖水系对水质的影响具有十分重要的意义。

4结束语

本研究建立了荧光定量PCR检测方法，该方法灵敏度高、精确度高、检测范围宽重复性好，相对于传统的显微镜检法，该方法可以研究水华发生提供方便快捷的检测途径。

参考文献：

［1］许川，舒为群，曹佳.我国水环境微囊藻毒素污染及其健康危害研究.癌变畸变突变，2007，（3）：202-205．

［2］张敬平，肖付刚，赵晓联等.微囊藻毒素分析检测技术.北京：化学工业出版社，2009．

［3］Al-tebrinehJ，GehringerM，AkcaalanRetal.AnewquantitativePCRassayforthedetectionofhepatotoxigeniccyanobac-teria.Toxicon，2011，57（4）：546-554．

［4］RantalaA，RizziE，CastiglioniBetal.Identificationofhepatotoxin-producingcyanobacteriabyDNA-Chip.EnvironmentalMicrobiology，2008，10（3）：653-664．

［5］OuahidY，delCampoFFD.TypingoftoxinogenicMicrocystisfromenvironmentalsamplesbymultiplexPCR.AppliedMicro-biologyandBiotechnology，2009，85（2）：405-412．

［6］XinZG，JeffPV，MelvinQetal.High-throughputDNAextractionmethodsuitableforPCR.Biotechniques，2003，34（4）：820-824．

［7］VaitomaaJ，RantalaA，HalinenKetal.QuantitativeReal-timePCRfordeterminationofmicrocystinsynthetaseEcopynumbersforMicrocystisandAnabaenainlakes.AppliedandEnvironmentalMicrobiology，2003，69（12）：7289-7297.