用串联质谱技术（LC-MS/MS）分析DBS类固醇激素的方法学初探

用串联质谱技术（LC-MS/MS）分析DBS类固醇激素的方法学初探

文伟郭萌彭红兵

（深圳市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心广东深圳518000）

【摘要】目的：探讨用液相色谱质谱技术（LC/MS/MS）检测肾上腺皮质类固醇激素的方法。方法：采用多反应监测（MRM）分析模式检测干血斑标本（DBS）中17-OHP、雄烯二酮(androstenedione，4-A)和皮质醇（cortisol）等类固醇激素谱，进行定量分析。观察样品定量检测限（LOQ）、变异系数和回收率等指标，分析该检验方法的灵敏度和特异性。结果：使用WatersUPLCI-ClassXevoTQ-D系统结合HSST3色谱柱建立了干血斑DBS中5种激素同时测定的分析方法，皮质醇、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮和17-羟孕酮等5种激素在XevoTQ-D系统在标准曲线范围内呈线性，线性拟合系数r2均>0.99。最低定量限在5～10ng/ml之间。信噪比大于三倍最低定量限。具有较好的灵敏度，线性关系和重现性结果。结论：串联质谱技术可应用于皮质类固醇激素检测，灵敏度和特异性较高，有开展二线筛查的可行性。

【关键词】先天性肾上腺皮质增生症（congenitaladrenalhyperplasia）；类固醇激素（steroidhormone）；新生儿筛查（newbornscreening）；17-羟孕酮（17-α-hydroxyprogesyerone）；液相色谱质谱（LC/MS/MS）

【中图分类号】R722.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）31-0052-03

先天性肾上腺皮质增生症（congenitaladrenalhyperplasia，CAH）是一类常染色体隐性遗传代谢病，由于遗传因素导致皮质类固醇激素合成障碍，导致代谢紊乱，出现一系列电解质紊乱、性激素分泌紊乱等导致代谢紊乱和发育异常，严重者危及生命。其中最常见的是21-羟化酶缺乏症（CYP21A2）和11-β-羟化酶缺乏症（CYP11B1）。盐皮质激素合成障碍导致失盐危象，症状包括喂养困难、发育缓慢、呕吐、高钾、低钠、脱水、代谢性酸中毒。目前，新生儿生后3天（72小时后）采集新生儿足跟血制成滤纸干血斑（DBS）进行新生儿筛查检测，用免疫法检测干血斑中17-羟孕酮（17-α-hydroxyprogesyerone，17-OHP），早期筛查21-羟化酶缺乏症。但是常规新生儿筛查方法用免疫荧光法检测干血斑中17-OHP浓度时，由于新生儿生理原因和基质效应导致假阳性率偏高。增加了婴儿家属不必要的心理负担和医疗资源的浪费[1]。

采用LC-MS/MS对DBS标本的17-OHP、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇（21-Deoxycortisol，21-F）、雄烯二酮（4-A）和皮质醇（Cortisol）等类固醇激素定量分析，本研究采用LC-MS/MS对干血斑样品中这五种激素进行定量分析方法及性能验证，提高检测灵敏度和特异性，减少基质效应。

1.对象与方法

1.1研究对象

用Schleicher&Schuell903＃筛查专用滤纸制备的类固醇激素干血斑标准品。

1.2设备与试剂

1.2.1液相系统WatersACQUITYUPLCI-Class；质谱系统：XevoTQ-D。

1.2.2分析软件MassLynx及Intellistart进行线性拟合分析、RSD分析、回收率计算等统计学分析。

1.2.3试剂和标准品购自Sigma、CDN、MERK、CanadaTRC等，色谱级。

1.3技术条件

1.3.1质谱参数

表1通过手动调谐结合Intellistart自动调谐，确定的

1.4DBS类固醇标准品制备与处理

1.4.1DBS类固醇标准品的制备

将健康人抗凝血液9000×g离心5分钟，去上清液，得到健康的红细胞；红细胞内加入等体积的生理盐水进行冲洗，离心后去除上清液，重复三次，得到干净的红细胞；洗净的红细胞与牛血清白蛋白标准缓冲（4%BSA）混合，制成含55%红细胞的不含类固醇激素全血标准品。取适量的上述全血标准品，分别加入类固醇4-A、17-OHP、F、21-F、11-脱氧皮质醇标准品，稀释成相应浓度，各取50ul滴到Schleicher&Schuell903＃筛查专用滤纸纸片上，室温晾干（6h左右），即成为DBS类固醇标准品，存放于4℃冰箱待用[2]。

1.4.2DBS类固醇样品的分析

待测样本用打孔钳打4个直径3mm干血斑（相当于12μL全血）于96孔聚丙烯微孔板中；每孔加入200μL丙酮：乙腈（50:50）溶液，20μL内标工作液，室温涡旋混合约50分钟；再加入100μL甲醇，室温涡旋混合约10分钟；将每孔样本转移到另一洁净96孔板中，40℃氮气吹干。每孔加入含有0.1%甲酸的甲醇水（50:50）50ul复溶，室温涡旋混合约1分钟，待进样分析。

2.结果

F、21-F、11-脱氧皮质醇、17-OHP、4-A五种类固醇激素色谱分离（图1～图6，表4）

3.讨论

LC/MS/MS技术主要是将被测物质分子电离成质荷比（m/s）不同的带电粒子，然后应用电磁学原理，使这些带电粒子按照质荷比大小在空间或时间上产生分离、排列成的图谱，通过测定离子峰的强度，以此获得确定化合物的相对分子质量、分子式。质谱峰的强度与它代表的化合物的量成正比，而且混合物的质谱是各成分质谱的算术加成谱，据此，可以进行定量分析。LC/MS/MS基本原理就是将两个质谱仪经一个碰撞室串联而成，既用质谱仪做混合物样品的分离器，又用质谱仪作为组分的鉴定器。LC/MS/MS技术有高敏感性，高效、快捷的特点，弥补了传统的免疫方法筛查的不足[3]。

我们的研究中对干血斑标本皮质醇、17-OHP、11-脱氧皮质醇、21-F和4-A等类固醇激素标准品制备，确定了采用WatersUPLCI-ClassXevoTQ-D系统结合HSST3色谱柱系统手工和自动调谐，确定质谱参数和MRM离子对参数。通过分别对标准品的检测，分析了每个类固醇激素的线性范围、最低定量限和信噪比等参数。结果显示线性拟合较好。

由于正常婴儿中类固醇激素尤其17-OHP较低，而CAH或应急状态的婴儿类固醇激素会增高，由于该设备的最低检测限为5～10mg/ml，正常婴儿的类固醇激素水平在最低检测限附近，检测结果可靠性受影响，但是CAH患者或由于其他疾病、应激等原因导致17-OHP明显增高时，检测灵敏度和准确性增加。采用相关类固醇激素的比值可以更敏感反应疾病状态、生理应激状态或其他疾病导致的继发反应，减少筛查假阳性，应用串联质谱技术进行“二线筛查”[4]。

4.结论

4.1使用WatersUPLCI-ClassXevoTQ-D系统结合HSST3色谱柱建立了DBS中5种激素同时测定的分析方法，分析方法运行时间5min。其中皮质醇、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、4-A和17-羟孕酮的保留时间分别为：1.76’、2.19’、2.42’、2.74’和3.10’。

4.2皮质醇、21-F、11-脱氧皮质醇、4-A和17-OHP等5种激素在XevoTQ-D系统D的标准曲线范围内呈线性关系，线性拟合系数r2均＞0.99。最低定量限在5～10ng/ml之间。信噪比大于三倍最低定量限。具有较好的灵敏度，线性和重现性结果。4-A、17-OHP、11-deoxycortisol、21-F及Cortisol定量下限分别为2.5、5、2.5、10、5ng/mL，线性范围分别为2.5～160ng/mL、5～320、2.5～320、10～320、5～160ng/mL；5种激素的DBS样品连续测定6针的RSD均在15%以内。

图6Cortisol的线性拟合结果

①线性范围：5～160ng/ml，r2=0.9909；②最低定量限为5ng/ml，信噪比为14。

【参考文献】

[1]NermoenI,HusebyeES,MyhreAG,KristianL?v?s,etal.ClassiccongenitaladrenalhyperplasiaTidsskrNor[J].Legeforennr,2017,137(7):540-543.

[2]SarafoglouK,HimesJH,LaceyJM,etal.Comparisonofmultiplesteroidconcentrationsinserumanddriedbloodsplotsthroughout,thedayofpatientswithcongenitaladrenalhyperplasia[J].HormResPaediatr,2011,75(1):19-25.

[3]N.Janzen,M.Peter,S.Sander,etal.NewbornScreeningforCongenitalAdrenalhyperplasia:AdditionalSteroidProfileusingLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry[J].JClinEndocrinolMetab,July2007,92(7):2581-2589

[4]RossiC,CalronL,BrownHA,etal.Congirmationofcongenitaladrenalhyperplasiabyadrenalsteroidprofilingoffilterpaperdriedbloodsamplesusingulter-performanceliquidchromatography-tandemmassapecriometry[J].ClinChem.LabMed,2011,49(4):677-684

（深圳市卫生计生科研项目，编号：20152002）.