病毒性皮肤病的基因治疗

病毒性皮肤病的基因治疗

赵宇辉

赵宇辉（七台河市七煤集团医疗中心新兴医院154600）

【中图分类号】R751【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）35-0125-02

【关键词】病毒性皮肤病基因治疗

狭义的基因治疗可以理解为将具有正常功能的基因置换或增补患者体内缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。目前基因治疗的概念已超出这个范围，广义地理解为将某遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。

基因治疗在肿瘤、遗传性疾病和传染病的治疗中有十分重要的应用前景，在治疗一些难治性病毒性皮肤病中也有重要意义。根据针对宿主病变细胞基因采取的措施不同，基因治疗可分为基因置换(genereplacement)，基因修正(genecorrection)，基因修饰(geneaugmentation)，基因失活(geneinactivation)和基因疫苗(genevaccine)等五大策略。根据其表达产物的靶位点不同，大致可分为基于核苷酸或基于蛋白质的两种策略。

一、应用核苷酸治疗策略

主要通过干扰病毒在细胞内的复制过程达到治疗目的，其优点在于特异性强，对细胞蛋白的正常功能影响较小，免疫原性较弱，易于体外的大量合成。

(一)RNA诱饵

人免疫缺陷病毒(HIV)基因调控存在着极为复杂的顺式和反式调节机制，这些调节机制已成为设计抗病毒基因治疗方案的重要依据。HIV反式调节(transregulation)与HIV基因组复制和表达有着极为密切的关系没有足够的反式激活剂的结合与刺激，HIV、RNA就不能进行有效的复制和表达。诱饵(decoy)分子指的是能与HIV、RNA竞争性与反式激活剂结合的RNA片段，诱饵RNA分子表达载体的设计和基因治疗是抑制HIV复制和表达的重要策略。针对HIV来说，诱饵设计最为常用的基因片段为Tat和Rev等。为了提高诱饵的表达水平及抗病毒作用，可将多个诱饵的编码基因头尾串联在一起，这样可提高表达的诱饵的分子数，提高其抗病毒的作用。病毒基因的反式调节机制，不仅是设计抗病毒基因治疗直接的理论根据，而且还为提高目的基因的表达水平提供了有效的手段。

(二)反义核苷酸

反义核苷酸包括反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN，oigodeoxynucleotide)和反义RNA两种，是指一小段(14～23碱基)人工合成的单链核苷酸片段，它可与病毒基因组中特定区域杂交结合成稳定的互补结构(即RNA-DNA杂交)，从而抑制病毒的复制。反义核苷酸与其序列互补的靶以碱基酸对方式结合，阻断基细胞内的转运，剪切加工，并与核糖体的结合激活内源性的核酶(如RNaseH等)将其分解，以抑制或阻断某一基因的表达和功能。这一基因表达调控的机制，目前已应用于抗病毒基因治疗的研究。ChaReljee等应用腺相关病毒(AAV)载体构建了HIV、RNA的反义RNA的表达载体，将这种重组表达载体导入T淋巴细胞中，表达的反义RNA可与HIV、LTR、TARA的一段63bp的序列互补。这种反义RNA的表达，对HIV-I的抑制率达70％～90％。反义RNA不仅在控制HIV-1感染中具有重要作用，而且在控制疱疹病毒、人乳头瘤病毒(HPV)，劳氏肉瘤毒(RSV)等的感染中都有重要应用。反义核苷酸用于治疗时，它在体内的稳定性及进入细胞的效率存在着许多问题。为提高其稳定性，可将合成的反义核苷酸进行化学修饰，如甲基化、烷基化、硫代化，5’端、3’端偶联某些基团或某些具有高级结构的核酸片段，能较好地增强其抑制病毒复制的效果。目前，反义核苷酸是一种很有潜力而且理想的基因靶向药物。

(三)核酶

核酶(ribozyme)是一种具有酶的催化作用，能够在GUC等特定的核苷酸序列的下游切割RNA分子特异性裂解RNA转录体的一类小RNA分子。核酶高效特异裂解RNA底物的性质，作为抗病毒基因治疗的新型分子，受到了广泛的重视。从理论上来讲，只要了解底物RNA的系列及结构性质，就能设计出针对任何RNA分子的特异性核酶。核酶的本质是RNA，从自然界中提取纯化针对特异基因片段的核酶RNA分子是行不通的。人工RNA的合成是一条途径，但价格昂贵，没有实用前途。基因RNA制药又没有突破性的进展。因此，核酶的实际应用还需走基因治疗的途径。即体外设计核酶的编码基因，以反转录病毒载体导入到靶细胞中进行表达。这种基因治疗的策略经过较为周密的细胞及动物水平的系统研究，美国已于1994年开始抗HIV基因治疗的I期临床实验，而融合素基因特异性的核酶的分子设计，可能是抑制或阻断HIV感染靶细胞的基因治疗的新手段，相信核酶抗病毒基因治疗途径在未来的抗病毒基因治疗研究中将发挥更大的作用。

二、应用蛋白质治疗策略

应用蛋白质治疗策略可干扰病毒在细胞内的复制或促进杀伤被病毒感染的细胞，例如，通过淋巴因子转基因表达抗病毒蛋白、通过病毒抗原或保护性抗体编码基因的转基因诱导表达或表达保护性抗体、通过特异性辅助分子转基因表达分子抗体阻断病毒进入细胞的过程及细胞内免疫策略设计等在研究中均表现出了很好的应用前景，由于其机制与抗病毒免疫关系密切，主要内容将在下一章中涉及，这里仅简单介绍反式显性突变体及病毒感染细胞的自杀机制在抗病毒基因治疗中的应用。

(一)反式显性突变体

病毒的反式显性突变体在病毒蛋白的重要功能区含有突变，这种蛋白突变体在转录后水平上发挥作用，可以与有活性的病毒蛋白竞争结合靶序列或与野生型病毒蛋白形成二聚体或多聚体而使病毒蛋白失活，从而达到抗病毒的作用。这种策略目前已应用于抗HIV的研究，同时，病毒的反式显性突变体也是确定病毒蛋白功能区的一个有用工具。

(二)自杀基因疗法

自杀基因疗法(suicidegenetherapy)是一种广泛应用的基因治疗方法，自杀基因转移到细胞后将无毒性的前体药物代谢为细胞毒药物，首先可使导入自杀基因的细胞“自杀”，其次，可发挥旁观者效应杀死未导入自杀基因的邻近细胞，显著地扩大其杀伤作用。自杀基因治疗在肿瘤、血管增殖性疾病中显示了一定的治疗的潜力，在病毒性疾病中，包括蛋白质和RNA在内的感染因素的持续高水平的表达是细胞内免疫难以取得彻底治疗效果的一个重要原因，设计清除病毒感染细胞而不是单纯干扰病毒的复制和表达过程的基因治疗方案具有重要意义，导入自杀基因的基因治疗策略在这一领域中占有重要地位。

自杀基因又称前体药物酶转化基因、药物敏感基因或酶-前体药激活基因，这些基因大多存在于病毒、细菌或真菌等细胞中，如白喉毒素(DTA)在极低水平的情况下即可引起细胞发生死亡，如水痘－带状疱疹病毒(VSV)胸腺嘧啶核苷激酶(TK)，可使无毒的丙氧鸟苷(ganciclovir，GAV)转换为毒性极强的代谢产物杀死细胞；而前体药物大多是抗感染的药物，对这些微生物具有细胞毒作用。每种自杀基因系统都包含一种酶和一种前体药物，目前常利用的主要有tk-GCV(胸苷激酶基因-丙氧鸟苷)系统、CD-5-FC(胞嘧啶脱氨酶基因-5-氟尿嘧啶)系统等。这些系统已有应用于病毒性疾病的治疗，如HIV感染的患者骨髓移植后必须重建或增强机体的抗HIV的免疫力，为此可在患者体内注射宿主来源的gag特异性的CD8+的CTL细胞。因为宿主受HIV感染，因此，CD8+的CTL细胞可能会大规模杀伤HIV感染的宿主细胞，为此，将此T细胞克隆用反转录病毒作为载体转移HSV-tk基因和hydromycinB抗性基因。这样如果产生毒性，体内注射GCV就可以清除这些克隆。

自杀基因的导入，除了可以有效地杀伤被转导的细胞外，还通过旁观者效应和诱发免疫反应杀死周围的细胞，在治疗病毒性疾病的另一方面的关键则是保证细胞自杀的范围仅限于病毒感染的细胞，而对于正常细胞没有不良反应。靶向性自杀基因治疗策略的运用可能有助于解决这个问题，这种基因治疗的方案也可以利用病毒感染细胞的特点进行设计。法国Klatzman等根据HIV及其感染细胞的特点设计了HIV感染细胞的自杀机制，取得了较为满意的治疗效果。首先，将白喉毒素基因重组到缺失突变HIVLTR启动子的下游，如果细胞中没有HIV的感染并提供反式激活蛋白，白喉毒素就不会表达；但如果细胞感染了HIV，病毒的复制和表达过程同时为白喉毒素的表达提供了反式激活剂，白喉毒素经刺激表达以后，可以引起HIV感染细胞的自杀死亡。没有感染HIV的细胞不存在反式激活蛋白，白喉毒素不表达，可以完好存活下来。利用这种机制就能选择性地清除病毒感染的细胞。

总之，现阶段病毒性皮肤病的基因治疗与其他方面的基因治疗一样，还有许多问题要深入研究，如目的基因的选择，病毒表达载体的安全性，表达基因的选择及基因转移靶细胞的选择和其导入方法，基因导入靶细胞后其表达产量低，治疗结束后如何终止导入基因的表达等。

参考文献

[1]雍磊,程相铎,李波,李伟伟.变应性皮肤病患者血清IgE和ECP分析[J].中国麻风皮肤病杂志;2005年11期.