苦参碱影响肺纤维化大鼠病理及氧化应激水平

苦参碱影响肺纤维化大鼠病理及氧化应激水平

陈哲张秀峰

陈哲张秀峰

（南华大学附二医院湖南衡阳42100）

本课题由湖南省卫生厅科研计划项目（编号：B2009058）资助

【摘要】目的：研究苦参碱对博来霉素诱导的肺纤维大鼠病理变化及氧化应激的影响，探讨苦参碱在肺纤维化治疗中的作用及可能机制。方法：120只健康雄性SD大鼠随机分为空白对照组（A组）、博来霉素组（B组）、泼尼松组（C组）、苦参碱50mg组（D组）、苦参碱100mg组（E组），使用博来霉素气管注射法复制肺纤维化大鼠模型，D、E组分别注入苦参碱50，100mg/kg，1次/d；C组注入醋酸泼尼松0.56mg/Kg，1次/d，分别于7d、14d、28d每组各随机处死大鼠8只，取肺组织HE及Masson染色；ELISA法检测8-异前列腺素浓度；westernblot法检测肺组织γ-GCS蛋白质的表达。结果：①实验模型组有程度不等的肺泡炎及明显纤维化。各治疗组肺泡炎及肺纤维化程度减轻，与模型组相比差异显著，大剂量苦参碱组度减轻更显著（P＜0.05）。②实验模型组有程度不等的8-异前列腺素浓度升高，与模型组相比差异显著；大剂量苦参碱组升高幅度最低P＜0.05）。③实验模型组表现有程度不等的γ-GCS升高，与模型组相比差异显著（P＜0.05）。结论：1.苦参碱能抑制博来霉素诱导的大鼠肺纤维化；2.苦参碱可能是通过调节氧化/抗氧化平衡而发挥抗纤维化作用。

【关键词】肺纤维化；谷氨酰半胱氨酸合成酶；肺系数；苦参碱

【中图分类号】R256.1【文献标识码】B【文章编号】1007-8231（2011）12-2231-03

肺纤维化是许多肺间质疾病的共同结局，发病机制尚未完全明确，临床缺乏特异的治疗药物［1］，病情一般持续性进展，最终多死于呼吸衰竭［2］。近年研究发现，氧化/抗氧化失衡可能在肺纤维化发病机制中发挥重要作用［3-6］。苦参碱具有抗纤维化作用，本实验使用苦参碱对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠进行干预，探讨其对肺纤维化的保护作用及其机制，为临床使用苦参碱治疗肺纤维化提供理论依据。

1材料和方法

1.1主要试剂醋酸泼尼松片（天津太平洋制药有限公司生产）；注射用盐酸博来霉素（日本化药株式会社生产）；注射用苦参碱（江苏正大天晴药业股份有限公司生产）

1.2实验动物健康SD雄性大鼠120只（由南华大学动物室提供），10周龄左右，体重200±13g，喂养于南华大学动物室。按随机数字表法随机分成5组：空白对照组（A组）、博来霉素组组（B组）、泼尼松组（C组）、苦参碱50mg组（D组）苦参碱100mg组（E组），每组各24只。按陈祥银等［7］报道的方法制备肺间质纤维化模型。A组气管内注入生理盐水200μl；B、C、D、E四组气管内分别注入200μl含100μgBLM-A5（5mg/kg）的无菌生理盐水。

1.3给药方法造模后第1d起，空白对照组及博来霉素组经胃管注入生理盐水2ml，每天1次；泼尼松组经胃管注入醋酸泼尼松片0.56mg/kg体重，每天1次；苦参碱50mg组和苦参碱100mg组分别经胃管注入苦参碱50mg/kg体重、200mg/kg体重（溶于2ml生理盐水），每天1次。

1.4标本处理分别于造模后第7d，14d，28d处理，每批每组随机抽取8只，取腹主动脉血后处死；分离肺脏，常规脱水、包埋、切片、脱蜡，行HE染色或Masson胶原染色后，脱水、封片、光学显微镜下观察并照相；余肺组织置经DEPC水预处理后高温消毒的EP管中，以液氮罐迅速转移至-80℃冰箱保持。

1.5结果获取

1.5.1肺系数的计算计算方法为：肺系数=肺重（mg）/体重（g）。

1.5.2肺泡炎症、肺纤维化程度判断右肺石蜡切片进行HE、Masson染色，在光学显微镜下观察肺组织病理学改变。参照Szapiel等［8］的方法用HE染色评定肺组织肺泡炎症程度(-～+++)，Masson染色评定肺组织纤维化程度(-～+++)。

1.5.3γ-GCS蛋白表达检测右肺组织解冻后行免疫印迹（Westernblot）检测。图像分析系统（上海TanonGis-2010）对扩增产物条带吸光度半定量，计算待测条带的吸光度×面积与内参照β-actin的吸光度×面积的比值。

1.5.4γ-GCSmRNA表达检测右肺组织按说明书用TRIZOL试剂（上海生工）提取总RNA，使用逆转录试剂盒（MBIFermentas公司）逆转录（reversetranscription，RT）后进行聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）。RT-PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统（上海TanonGis-2010）对扩增产物条带吸光度半定量，计算待测条带的含量与内参照β-actin含量比值。引物序列、退火温度、产物长度、循环数见表1。

表1引物序列、碱基数、退火温度和循环数

1.2统计学分析

计量资料采用均数±标准差表示（x±s）表示，用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料行方差齐性检验后，多组样本比较采用单因素方差分析，LSD法行两两比较；各指标间行直线相关性分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1SD大鼠肺纤维化模型肺部的病理学变化

2.1.1肺系数正常对照组的肺系数，各时间段无明显变化。造模后，模型组肺系数明显增高，第14天达最高峰，各实验组在各时间段均较对照组增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与实验模型组比较，泼尼松组及苦参碱50mg组均能降低肺系数（P＜0.05），且苦参碱200mg组更能降低肺系数（P＜0.01）（见表2）。

表2各组大鼠不同时间点肺系数比较（x±s，n=8）

注：“a”P＜0.05与对照组比较；“b”P＜0.05“c”P＜0.01与实验模型组比较。

2.2.2肺组织病理学改变光镜观察见图1，正常对照组：肺内结构清晰，无水肿及纤维化表现，少数大鼠肺组织可见轻度炎细胞浸润。实验模型组：各时期均表现有程度不等的肺泡炎，其中以14d最重，肺泡腔及肺间质内有大量炎性细胞浸润，以巨噬细胞、淋巴细胞浸润为主，肺组织明显充血、水肿，肺泡间隔增宽；造模各组7d未见明显纤维化表现，而于14d开始发生纤维化，28d呈中、重度肺纤维化改变，肺泡结构破坏或消失，少量炎症细胞浸润，肺组织以胶原沉积、肺纤维化改变为主（见图1-2）。各治疗组肺泡炎及肺纤维化程度减轻，与模型组相比差异显著，而大剂量苦参碱组其肺泡炎及肺纤维化程度减轻更显著（P＜0.05）。各组大鼠肺泡炎分级见表3，纤维化分级见表4。

7d14d28d

图1右肺上叶组织HE染色×400

图2各组大鼠肺组织28dMasson染色结果×40

表3各组大鼠不同时间点肺泡炎评分比较（x±s，n=8）

注：“a”P＜0.05与对照组比较；“b”P＜0.05与实验模型组比较。

2.3血浆中8-异前列腺素浓度

2.3.1各组血浆中8-异前列腺素浓度组间比较大鼠腹主动脉血浆中8-异前列腺素浓度，在7d及14d，B、C、D、E组与A组比较均显著升高（P＜0.01），C、D、E组低于B组（P＜0.01）。第28d时，B、C、D组与A组比较均显著升高（P＜0.01），C、D、E组低于B组（P＜0.01）；E组低于B、D组（P＜0.01），与空白对照组差异无统计学意义（P＞0.1）（见表2，图2）。2.3.2血浆中8-异前列腺素浓度各组内各时间段间比较

大鼠腹主动脉血浆中8-异前列腺素浓度各组内各时间段间比较，A组各时间段间无显著差异（P＞0.1）；B、C、D、E组均示7d时即以显著增高，并呈上升趋势，第14d时达顶峰，其后呈下降趋势，28d时较7d、14d均显著下降，但仍维持较高水平（P＜0.1）（见表5）。

表5各组血浆中8-异前列腺素浓度组间比较（x±s）（单位：pg/ml）

注：“a”P＜0.05与对照组比较；“b”P＜0.05与实验模型组比较；“c”P＜0.05与泼尼松组比较；“db”P＜0.05与苦参碱50mg组比较。2.3.3γ-GCS蛋白表达

肺组织中γ-GCS蛋白表达相对值各组间比较，在7d、14d、28d三个时间段，B、C、D、E组γ-GCS蛋白表达均高于A组（P＜0.05）；其中C、D、E组高于B组（P＜0.05）。

各组肺组织中γ-GCS蛋白表达相对值，各组内不同时间段间比较，A组在不同时间段比较，无显著性差异；B、C、D、E组γ-GCS表达以7d较高，28d较低，但仍高于对照组，有随时间下降趋势（见表6）

表6肺组织中γ-GCS蛋白表达组间比较（x±s，n=8）

注：“a”P＜0.05与对照组比较；“b”P＜0.05与实验模型组比较。

3讨论

博莱霉素是从轮生链球菌中提取出的一组多肽类抗肿瘤抗生素，大量临床和动物实验均已证明其可引起肺纤维化，被视为诱导肺纤维化实验模型的经典方法，现被广泛用于肺纤维化动物实验［9］。使用博来霉素气管注射法复制肺纤维化大鼠模型，造模后7d时以肺泡炎为主要表现，出现大量炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚，成纤维细胞开始增多；14d时肺泡炎仍较重，纤维组织进一步增加；而28d时肺泡炎症较前减轻，主要表现为肺纤维化程度加重，部分肺泡腔消失，为大量胶原纤维、成纤维细胞、淋巴细胞所占据，符合肺纤维化的病理过程及特点，说明肺纤维化模型复制成功。C组、D组、E组炎症反应及纤维化程度低于B组，说明泼尼松和苦参碱能减轻博来霉素所致的大鼠肺纤维化；而E组肺泡炎及肺纤维化评分低于C、D组，但差异无统计学意义，提示苦参碱的抗氧化、抗纤维化作用可能具有剂量依赖性，但仍需进一步研究。

氧化抗氧化失衡在肺纤维化发病机制中发挥重要作用。正常情况下，肺部可产生不少氧自由基（oxygenfreeradical，OFR），但由于肺部含有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽转移酶等OFR清除酶或清除剂，能及时清除多余的OFR，不致对肺组织产生损害。一旦机体遭受感染、创伤、中毒、休克等因素的作用，OFR产生大大增多，而相应酶的功能相对降低或活性受抑，或其它非酶抗氧化物质减少，导致平衡失调，OFR相对或绝对过剩，攻击周围组织、细胞。

8-异前列腺素是脂质过氧化的产物，可反映机体内脂质过氧化程度，并间接反映出细胞损伤的程度。本研究发现：肺纤维化大鼠血浆中8-异前列腺素在7d即明显增高，14d达高峰，28d有所下降，但仍高于正常，其中在28d时，苦参碱100mg组虽绝对值仍高于空白组，但无统计学意义；而醋酸泼尼松组、苦参碱50mg组及苦参碱100mg组大鼠血浆中8-异前列腺素浓度较模型对照组低，提示肺纤维化大鼠体内存在过强的氧化应激反应，醋酸泼尼松和苦参碱对之有抑制效应，而苦参碱的抑制作用似乎具有剂量依赖性。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteinesynthetase，γ-GCS）作为一种非常重要的抗氧化酶，是谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成反应的限速酶。GSH可起到抗氧化、抑制炎症发展、降低气道高反应性、调节免疫、抑制气道重塑等作用［10］。而γ-GCS表达与GSH水平高度相关，γ-GCS表达能够代表宿主体内抗氧化能力。

苦参碱（Matrine）是苦参型生物碱的主要活性成分。其具有抗纤维化、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗风湿、抗心律失常等作用以及对中枢神经系统的镇静、镇痛解热降温作用和强心、降压、消肿利尿、免疫及生物反应调节作用等［11］，其中研究尤为较多的是其抗炎以及抗成纤维细胞增殖作用。

本研究发现予以苦参碱干预后，肺组织中γ-GCSmRNA及蛋白表达较造模对照组显著增高，提示苦参碱能通过促进内源性抗氧化酶的表达发挥抗氧化、抗纤维化作用参考文献

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