脱水过度大鼠胰腺组织的补救处理方法探讨

脱水过度大鼠胰腺组织的补救处理方法探讨

左雅敏徐臣利彭兴春王珏

湖北医药学院基础医学院湖北医药学院临床病理检验与会诊中心左雅敏徐臣利彭兴春王珏

摘要：目的探讨脱水过度胰腺组织的补救方法，以提高切片质量。方法收集脱水过度的SD大鼠胰腺组织30例，通过调整组织切片补救的不同处理方法和修复液，设对照组找到最佳补救方法。结果采用高温高压能够较好地改善胰腺组织脱水现象，以压力锅喷气即刻停止时效果最佳。结论高温高压处理法是提高脱水过度动物胰腺组织的有效补救方法，具有更强的适用性，组织约可恢复至90%。

关键词脱水过度；胰腺组织；补救方法；比较

[中图分类号]R285.5[文献标识吗]-A[文章编号]1439-3768-（2019）-WJK

全自动组织脱水仪是病理科常用设备，各来源器官的脱水时间通常是由器官组织结构决定[1]，对于人体与动物不同脏器标本应采取个性化的组织脱水程序[2-4]。然而，病理日常标本工作量大，科研的动物标本如果要分别处理，往往耗费较多的时间与试剂。近来，本实验室对大鼠胰腺组织按“常规脱水时间和流程”制备石蜡切片时发现，因脱水过度导致组织变脆切片易碎，造成后续实验无法进行。虽有对不同动物脏器处理程序的相关研究，但说法不一[5]。因此，本研究拟选择SD大鼠为对象，处死后取其胰腺分别进行组织学切片，选择高温高压、水煮等不同修复条件处理，观察并比较脱水过度胰腺组织切片在不同处理条件下的染色效果差异，以期找出最佳的补救方法，达到节流开源的目的，现介绍如下。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

根据实验要求取SD大鼠胰腺组织，大小为1.5cm×1.0cm，厚度为0.3-0.5cm，化学试剂为梯度乙醇，蒸馏水，二甲苯，石蜡（熔点58~60℃）。

1.1.2试剂配制

0.01mol/L枸橼酸盐（pH=6.5）：取一袋粉制枸橼酸盐缓冲液加蒸馏水至1000mL。

10×Tris-EDTA修复液（pH=8.0）：精密称取Tris缓冲盐约30.27g，EDTA盐约1.461g，添加蒸馏水至500mL，临用前稀释10倍，即可。

1.1.3试验仪器

本试验所用的仪器主要是精密电子天平（JA1003型）、恒温箱（WGL-65B型）、包埋机（YB-7LF型）、自动组织脱水机（LS-TSG型）、轮转式切片机（LeicaRM2235型）、摊片机（TK-218型）等。

1.2试验方法

1.2.1组织处理流程

常规脱水时间和流程：（1）10%中性福尔马林充分固定2~3h；（2）75%，85%，95%乙醇各90min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各30min；（3）二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30min；（4）浸蜡温度58~65℃：石蜡Ⅰ、Ⅱ各30min；石蜡Ⅲ40min。

1.2.2组织切片补救修复处理的方法

组别Ⅰ高温高压补救修复法：（1）枸橼酸盐法：取枸橼酸盐缓冲液适量（约1000mL）于高压锅中0.1MPa（121℃），大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片加上，放入沸腾的缓冲液中。盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气将压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后可在自来水龙头下加速冷却），取出玻片，流水冲洗。（2）EDTA修复液和蒸馏水修复：方法同上。

组别Ⅱ水煮加热补救修复法：方法同上。

组别Ⅲ对照组：取脱水过度的胰腺组织切片，按照常规流程进行处理。

1.3评价方法

手工切片4μm厚，选取三组方法制成的切片进行HE染色，分别对切片的褶皱、破碎、厚度、松散性、切片完整性、染色情况等6个指标进行评价，由两名资深医师进行双盲评片，每项指标的数据为评分均值，各项均为100分，以不少于80分为合格，统计例数。

1.4统计学分析

采用SPSS13.0软件进行统计学处理，实验结果采用Pearson2检验计数资料。

2结果

2.1补救修复前后胰腺组织的HE染色情况

本实验以胰腺组织HE染色为例，胰腺组织外分泌部为纯浆液性复管泡状腺，其水分含量较高，若按照常规方法处理，易造成胰腺组织着色不均匀，脆硬，切片易碎或易产生皱褶折叠、碎屑污染，影响制片和后续工作。补救修复后的方法制得的大鼠胰腺组织切片染色后镜下可见细胞质透彻，胞核清晰，组织结构完整。切片的褶皱、碎屑程度和染色情况均有较大改善，组织恢复大约90%。

2.2各组胰腺组织切片质量指标评价情况及不同补救方法HE染色效果图

采用高温高压补救修复方法切片的碎屑、褶皱、染色情况较对照组显著提高（P<0.05），结果见表1。其中，高温高压和水煮修复两种方法效果接近；而采用不同pH值修复液的染色效果有区别，本研究以高温高压方法比较枸橼酸盐、蒸馏水和EDTA修复液的HE染色效果。

表1各组胰腺组织切片质量指标比较（合格例数，%）

组别/指标类别无碎屑无褶皱无破碎厚度均匀切片完整染色情况组别Ⅰ（n=10)786858组别Ⅰ（%)708060805080组别Ⅱ（n=10)774656组别Ⅱ（%)707040605060组别Ⅲ（n=10)232743组别Ⅲ（%)203020704030Ⅰ,Ⅲ组比较P值0.020.020.060.610.650.02Ⅱ,Ⅲ组比较P值0.020.070.330.640.650.18

在临床和科研制片过程中，特别是小活检组织标本，无法重新取材或者经切片后所剩无几，更无法判读，后果严重。而组织脱水不当导致的染色不良问题一直没有较好的解决方法，特别容易发生在含水量多的腺体组织中，本研究以胰腺组织为例，通过高温高压或者水煮的方法实际上是对收缩过度的组织细胞进行水还原，主要是针对组织脱水过度造成的细胞皱缩。

本研究通过比较不同pH值的修复液（枸橼酸盐、蒸馏水和EDTA修复液）对切片补救的效果，结果表明偏碱性EDTA修复液切片的HE染色效果更佳，而中性修复液的细胞质染色偏浅、碱性修复液出现深染现象，该现象与染料的极性和组织所处的环境有关。最终确定以高温高压使用EDTA修复液效果最佳，本实验结果可为进一步优化实验方案提供借鉴与参考。

参考文献：

[1]王伯沄，李玉松，黄高昇等.病理学技术[M].北京：人民卫生出版社2006:77.

[2]徐思行，余心如.病理诊断及技术规范[M].杭州：浙江大学出版社，2003:18.

[3]赵阿红，宋一民，尹玉慧等.病理组织脱水的质量控制及管理[J].质控与安全，2009,30(3):111-112.

[4]范玲丽.病理制片质量控制的探讨及体会[J].临床与实验病理学杂志，2016,32（7）:823-824.

[5]敖焗钢，韩爱玲，钱琦琪等,大鼠不同器官组织的脱水方法改进[J].临床与实验病理学杂志，2017，33(3)：342-343.

document.getElementById('cnt-ad').style.display='none';