盐酸利多卡因眼用凝胶有关物质方法研究

盐酸利多卡因眼用凝胶有关物质方法研究

仲益

仲益（江苏省泰州市姜堰中医院江苏姜堰225500）

【摘要】目的研究盐酸利多卡因眼用凝胶中的有关物质检查方法。方法HPLC法。结果本方法专属性好，灵敏度度高。结论本方法适合于盐酸利多卡因眼用凝胶中有关物质的检查。

【关键词】盐酸利多卡因眼用凝胶物质研究方法

【中图分类号】R927【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）20-0028-02

1仪器与试药

1.1仪器

Waters2695高效液相色谱仪（Waters2996检测器、Waters2487检测器）

Agilent1200高效液相色谱仪（DAD检测器）

色谱柱：AgilentTC-C18（4.6×250mm）、汉邦ODS-AJS（4.6×250mm）、月旭AQ-C18（4.6×250mm）

1.2试药

磷酸二氢钠分析纯南京化学试剂厂

磷酸氢二钠分析纯南京化学试剂厂

磷酸分析纯南京化学试剂厂

甲醇色谱纯美国天地

乙腈色谱纯美国天地

2产品及现状

盐酸利多卡因眼用凝胶厂家：AkornIncorporated，商品名：AkornTM，包装：聚酯滴眼剂瓶装，贮藏：密封避光在15℃～25℃条件下保存，规格：5ml:175mg，批号：1B33B，有效期至2013年1月。

盐酸利多卡因原料BP2009标准详细列出了盐酸利多卡因可能存在的杂质为：杂质A为起始原料2,6-二甲基苯胺，杂质B为起始原料二乙胺部分被氧化后的副反应产物，杂质C为起始原料氯乙酰氯中混入杂质乙酰氯带进的副反应产物，杂质D为起始原料二乙胺中混入的乙胺带进的副反应产物，杂质E为起始原料二乙胺中混入的氨带进的副反应产物，杂质F为起始原料2,6-二甲基苯胺中混入的2,3-二甲基苯胺带进的副反应产物，杂质G为起始原料二乙胺中混入的2-丙胺带进的副反应产物，杂质H为合成利多卡因原料的关键中间体N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺，杂质I为起始原料2,6-二甲基苯胺中混入的2,4-二甲基苯胺带进的副反应产物，杂质J为起始原料2,6-二甲基苯胺中混入的2,5-二甲基苯胺带进的副反应产物，杂质K为起始原料二乙胺中混入的甲乙胺带进的副反应产物。

国内外利多卡因原料及制剂均控制“2,6-二甲基苯胺”，其他杂质归入最大单个杂质，实施限量控制。文献[染料产品中23种有害芳香胺的限量及检测方法]显示，在已知的23种有害芳香胺中，包含2,6二甲基苯胺等，长期接触该类物质可能引起具有急性肝中毒、肾损伤及致癌的毒性反应。

故研究者结合国内外利多卡因原料及制剂标准，初步确定对盐酸利多卡因眼用凝胶中可能含有的“2,6-二甲基苯胺、N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺”用外标法实施定量限量控制，其他杂质归入最大单个杂质，实施限量控制，并参照BP2009原料标准，用“2,6-二甲基苯胺”及“N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺”的分离度考察系统适用性条件。

3方法及结果

3.1流动相选择

取“盐酸利多卡因”、“2,6-二甲基苯胺（杂质Ⅰ）”及“N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺（杂质Ⅱ）”，用流动相制成各为35μg/ml的混合溶液，在检测波长为254nm及230nm的条件下，考察杂质Ⅰ与杂质Ⅱ的分离度及盐酸利多卡因峰型，结果表明流动相1条件下杂质与利多卡因的分离度良好，且主峰利多卡因峰形较好。

3.2测定波长选择

多波长检测数据显示：杂质Ⅰ、Ⅱ及盐酸利多卡因在254nm处的吸收均小于在230nm处的吸收，参照盐酸利多卡因将我公司研制的盐酸利多卡因眼用凝胶的有关物质检测波长确定为230nm。

3.3供试品浓度选择

BP2009原料标准中，有关物质检查供试液浓度为5mg/ml，中国药典2010版原料标准中，有关物质检查供试液浓度为2mg/ml，而眼用凝胶的浓度为35mg/ml，稀释10倍后浓度为3.5mg/ml，以3.5mg/ml的盐酸利多卡因溶液为基础，逐级稀释，测得盐酸利多卡因定量限浓度为1.4μg/ml，约为供试液浓度的1/5000，可见，该浓度下0.02%的杂质可被检出。故研究者确定有关物质检查供试液浓度为3.5mg/ml。

3.4专属性考察

供试品溶液中主峰保留时间为13.225min，杂质保留时间分别为4.903min、8.027min，主峰与相邻杂质的分离度为11.84。羟苯甲纤维素E4M、氯化钠及空白辅料溶液均在3min前出峰，对杂质及主峰的出峰无影响，专属性强。

3.5方法学研究

3.5.1杂质Ⅰ（已知杂质2,6-二甲基苯胺）的方法学研究

3.5.1.1定位试验及响应值考察

结果显示：2,6-二甲基苯胺与盐酸利多卡因的相对保留时间为0.646，响应值为4.51。

3.5.1.2定量限和检测限

取2,6-二甲基苯胺对照品适量，用流动相配成浓度为1.75mg/ml的溶液，将该溶液用流动相逐级稀释成适当浓度进样，定量限按峰高为基线噪音的10倍计算，此时进样浓度约为0.6728μg/ml，进样量为20μl，故2,6-二甲基苯胺定量限约为13.456ng，取定量限浓度溶液，重复测定6次，保留时间RSD为0.11%，峰面积RSD为1.18%；检测限按峰高为基线噪音的3倍计算，此时进样浓度为0.2243μg/ml，进样量为20μl，2,6-二甲基苯胺最低检测限约为4.485ng。

3.5.1.3对照品溶液稳定性试验

取浓度约为1.75μg/ml的2,6-二甲基苯胺对照品溶液，置室温条件下放置，分别于0、1、2、4、6、8、12、16、20、24小时依法进样20μl，峰面积的RSD为0.75%，说明2,6-二甲基苯胺对照品溶液室温放置24小时内稳定。

3.5.1.4标准曲线

精密称取2,6-二甲基苯胺约17.5mg（实称18.76mg），置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取该溶液适量，加流动相稀释制成2,6-二甲基苯胺分别约为0.750μg/ml、1.126μg/ml、1.501μg/ml、1.876μg/ml、2.251μg/ml、2.626μg/ml、3.002μg/ml的溶液，分别进样20μl，记录色谱图，结果表明：2,6-二甲基苯胺在0.750～3.002μg/ml范围内浓度与色谱峰面积线性关系良好。

3.5.1.5加样回收率试验

取有关物质检查项下供试品溶液，按外标法测定原有的2,6-二甲基苯胺的含量；另分别按溶液量的0.04%、0.05%和0.06%精密称取2,6-二甲基苯胺，平行制备高、中、低浓度9份，并计算2,6-二甲基苯胺的加样回收率，结果表明：已知杂质2,6-二甲基苯胺含量测定方法准确度良好。

3.5.2杂质Ⅱ（N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺）方法学研究

3.5.2.1定位试验及响应值考察

精密称取N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺及盐酸利多卡因适量，用流动相稀释分别制成含1μg/ml、2.5ug/ml、5ug/ml的混合溶液各2份，按确定的有关物质色谱条件进样测定，结果校正因子为1.24，相对保留时间平均值为0.51，RSD为0.29%。

3.5.2.2检测限、定量限

精密称取N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺对照品适量，配成3.5mg/ml的溶液，将该浓度溶液用流动相逐级稀释成适当浓度进样，考察N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺的检测限及定量限，定量限按峰高为基线噪音的10倍计算，此时进样浓度约为13.46μg/ml，进样量为20μl，故N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺定量限约为26.92ng；取定量限浓度溶液，重复测定6次，保留时间RSD为0.14%，峰面积的RSD为1.53%。检测限按峰高为基线噪音的3倍计算，此时进样浓度为4.49μg/ml，进样量为20μl，N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺最低检测限约为8.97ng。

3.5.2.3溶液的稳定性试验

试验结果表明N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺对照品溶液在室温条件下放置24小时内稳定。

3.5.2.4标准曲线

结果表明：N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺在1.504～6.018μg/ml范围内浓度与色谱峰面积线性关系良好。

3.5.2.5加样回收率试验

结果表明：已知杂质N-氯乙酰基-2,6-二甲苯胺含量测定方法准确度良好。

3.6进样精密度试验

取有关物质供试品溶液，按有关物质检查方法，连续进样6次，盐酸利多卡因峰面积的RSD为0.25%，2,6-二甲苯胺峰面积的RSD为1.94%，其他最大单杂峰面积的RSD为1.71%。

3.7供试品溶液的稳定性

取有关物质检查供试品溶液，置室温条件下放置，分别于0、1、2、4、6、8、12、16、24小时进样，考察主成分峰、单个杂质以及其他杂质总峰面积，结果供试品溶液中盐酸利多卡因主峰峰面积的RSD为1.3，2,6-二甲苯胺峰面积的RSD为2.1%，其他最大单杂的RSD为1.5%,结果表明有关物质供试品溶液室温放置24h稳定。

3.8有关物质检查重复性试验

取同一批样品平行配制6份供试品，按有关物质检查方法分别测定，结果表明：本品有关物质测定方法重复性好。

3.9有关物质检查中间精密度试验

由不同分析人员使用不同的仪器，在不同时间，测定同一批样品中的有关物质，结果表明：盐酸利多卡因有关物质测定方法精密度好，在不同的液相色谱仪上由不同人不同时间检查，各单个杂质及总杂质检测差小于0.05%。

3.10耐用性试验

3.10.1色谱柱型号及柱温考察

采用不同厂家C18色谱柱，将柱温微调为25℃、30℃、35℃，进行有关物质检查，结果显示：更换不同厂家的C18色谱柱及微调柱温为25℃、30℃、35℃，对有关物质检查无影响。

3.10.2流动相比例及pH值考察

本品流动相为：磷酸盐缓冲液-乙腈（50:50）用磷酸调节pH值至8.0，按有关物质检查方法，调整流动相比例为“45:55；50:50；55:45”，用磷酸调节流动相pH值至7.8、8.0、8.2，检查有关物质，结果显示：微调流动相比例及流动相pH值，对有关物质检查无影响。