导流杂交检测法在宫颈病变筛查中临床应用的研究

导流杂交检测法在宫颈病变筛查中临床应用的研究

张一琼彭伟

南昌大学第一附属医院江西南昌330006

摘要：目的评价导流杂交法检测女性生殖道人乳头瘤病毒（HPV）分型在宫颈病变筛查中临床应用价值方法从2009年5月—2012年6月在南昌大学第一附属医院妇科行宫颈癌筛查细胞学异常的患者中根据病理诊断选取560例患者，按组织病理学分为炎症组、宫颈上皮内瘤变（CINI）组、CINII组、CINIII组、宫颈原位癌组、浸润癌组和湿疣组各80例，各组随机选40例分别予以导流杂交法和原位杂交法进行检测HPVDNA检测和分型。分析HPV感染状况、结果HybriMax检测出HPV阳性233例，阳性率为83.2%。原位杂交共检测出HPV阳性例数157例，阳性率为56.1%，两者差异具有统计学意义。结论HybriMax对CINII以上病变的具有较高敏感度和阴性预测值，且能对更多基因型确切分型，可以作为HPV检测和宫颈病变筛查方法推广应用。

关键词：导流杂交；人乳头状病毒；宫颈癌筛查

宫颈癌是危害我国女性生活和健康的最重要的肿瘤之一，99.8%的宫颈癌样品中可以检测出人乳头瘤病毒（humanpapillomavims，HPV）的存在，高危型HPV持续性感染被认宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的主要致病因素，所以HPV分型检测对判断疾病类型、随访、流行病学分析及基因疫苗的研制都有重要意义。导流杂交基因芯片技术（flow-throughhybridization），即凯普导流杂交HPVDNA检测法（简称HybriMax）是近年来HPV基因型分型检测热门方法。本研究通过应用HybriMax检测女性生殖道人乳头瘤病毒分型，以原位杂交法（insituhybridization，ISH）检测的结果为对照，探讨HybriMax在HPV检测中的临床应用价值，同时初步探讨宫颈病变中常见的HPV基因型及比例。

一材料与方法

1.1研究对象与方法

1.1．1一般资料选择2009年5月-2012年6月在我院门诊或住院部行宫颈液基细胞学检查异常的患者，年龄25-66岁，所有患者均按知情志愿的原则，行阴道镜检查后取宫颈活检取得病理诊断，以病理学诊断为金标准，根据病理诊断选择560名患者。

1.1.2分组560例患者根据病理诊断随机分组：宫颈慢性炎症（炎症组）80例、宫颈上皮内瘤变（CIN）I组80例、CINII组80例、CINIII组80例、宫颈原位癌组80例、宫颈浸润癌80例、尖锐湿疣组80例，每组的年龄差异无显著性。

1.1.3方法各组随机等分，其中每组的40例用导流杂交技术检测基因分型，另40例用原位杂交法检测，观察两种方法对HPV的敏感度、基因分型、检测时间。

1.3结果判定：导流杂交法根据膜条HPV分型分布图，判断阳性点为何种病毒类型分型，由专业的检验科医生判读；原位杂交法杂交阳性信号为棕褐色，定位于鳞状上皮细胞核，在一张切片中发现≥1个阳性细胞即为HPV感染，由病理科医生判读。

1.4统计学方法：采用SPSS17.0软件进行统计分析，采用卡方检验，P<0.05为差异有统计意义。

二、结果

采用导流杂交法共检出HPV233例，阳性率为83.2%。原位杂交共检测出阳性例数157例，阳性率为56.1%，两者差异具有显著统计学意义（ⅹ2=48.78，P=0.000<0.05）。以病理诊断≥CINⅡ为金标准，导流杂交法和原位杂交法对CINⅡ以上病变（CINⅡCINⅢ、宫颈原位癌、浸润癌）的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值见表1

三、讨论

近20年来大量研究已经证实高危型HPV持续感染是CIN及浸润癌发病的必要条件。宫颈癌的发生发展是一个相对缓慢的过程，从HPV感染到宫颈癌要几年或10余年，这其中病变处于动态变化中，CIN发展为浸润癌总的风险率是15%[1]。在美国，宫颈癌筛查的主要目标就是治疗CINII或CINIII，而不是宫颈癌，因为宫颈癌的死亡率高，而CIN容易治愈。美国最新子宫颈癌筛查指出30-65岁女性，每3-5年应进行1次高危型人乳头瘤病毒检测，临床研究证明HPV检测可以作为宫颈癌的早期诊断和宫颈病变治疗后的随访指标。

HPV亚型分布存在地域性差异，我国地广人多，地区之间HPV亚型分布也有差异性。张东红和林美珊[2]采用Meta分析法综合评价1999年1月-2008年9月在国内发表的有关HPV在宫颈组织中感染及型别分布的相关研究中，发现南、北方地区HPV分型存在差异，北方地区HPV感染率（55.67%）高于南方地区（42.06%），两地区都以HPV16感染率最高，南方HPV58、18、33常见，北方58、52、33较常见。Chen等[3]通过对台湾地区10000名女性长达16年的跟踪研究发现：HPV16，52，58，18，31是最常见的导致宫颈癌的类型，细胞学正常HPV阳性宫颈癌风险大大高于HPV检测结果阴性。Chan等[4]检测533例港地区香港地区女性，发现最常见感染类型依次递减的是HPV16、58、53、18、33、45、52。江西省尚无大样本的研究报道，本研究发现最常见的5种高危HPV基因型别为HPV16、52、58、18和31，不同组织类型HPV亚型感染率稍有差异。其中宫颈癌患者中HPV16和HPV18感染率最高，本研究原位杂交法检测出HPV16/18阳性率达67.5%（27/40），与Muno?等[5]报道相符（67.74%）。Clifford等[6]研究发现HPV16和HPV18感染这更容易进展为宫颈浸润癌。美国国立综合癌症网络（NCCN）宫颈癌筛查实践指南及美国阴道镜检查和宫颈病理学会（ASCCP）指出，应特别注意HPV16、HPV18阳性患者，尤其是是对于年龄在30岁及以上的宫颈细胞学结果为阴性的妇女，应当进行电子阴道镜检查，并进行密切随访[7]，所以明确HPV型别有利于对感染者进行进行风险分类和管理。除了HPV16、18，很多研究发现HPV58、HPV52为我国的优势型别[8-9]，本研究发现HPV52、58亚型感染率在CINII、CINIII组患者感染率分别位于第二、第四，在宫颈癌患者中仅次于HPV16、18。所以，对于HPV52、58感染与致病力不容忽视，也应高度注意和密切随访，这为我们研究适合我国HPV预防疫苗提供了临床依据，尤其是HPV58，王鹤[10]等研究报道了HPV58复合型DNA疫苗可以作为HPV58阳性相关肿瘤及癌前病变免疫治疗的候选疫苗。HPV感染大大增加了宫颈癌的风险，本研究发现随着宫颈病变级别增高其感染率呈明显升高，HPV检测对宫颈癌筛查有着重要的临床意义。

目前HPV检查方法主要依赖生物分子学技术，其中第二代杂交捕获（hybridcapture，HC-II）是迄今惟一获得美国食品与药品管理局（FDA）认证，其对HPV检测灵敏度和特异性高，并广泛用于临床HPV检测，但其无法区分具体的HPV基因型，且不能判断多重感染，对于宫颈病变后的随访、HPV感染和重复感染的鉴别等方面受到了明显的限制。本实验采用导流杂交法是目前最快速的DNA杂交方法，整个过程4个多小时，能同时快速的对21种HPV基因进行分型，弥补了HC-II的不足，敏感性强、特异性高，病毒DNA最低检出量为350拷贝，且可判断多重感染。该方法是在杂交膜条上直接显示检测的结果，故实验结果客观、而且直观，适用于临床HPV感染的诊断以及官颈癌流行病学和病因学的研究。

综上所述，HPV对宫颈病变筛查有重要临床意义。导流杂交法HPV基因型检测具有操作简捷、结果清晰、准确等优点，值得在宫颈疾病的病因诊断中推广。目前我国各地区的医疗水平差异性也很大，我们面临的挑战是要普及HPV和宫颈癌筛查知识，让各个地区的女性，各年龄阶层的妇女都能享受到HPV检测，希望通过各方面的努力可以很大程度的降低宫颈癌的发病率和死亡率。

参考文献：

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[2]张东红，林美珊人乳头瘤病毒在国人宫颈病变中感染及型别分布特征Meta分析[J].中国全科医学，2010，13（12）：1287-1290.

[3]ChenHC，SchiffmanM，LinCY，etal.Persistenceoftype-specifichumanpapillomavirusinfectionandincreasedlong-termriskofcervicalcancer.JNatlCancerInst.2011；103（18）：1388–1397.

[4]ChanMK，MakKH，CheungNL，ChanDP，LoKK，CheungAF.GenotypespectrumofcervicalhumanpapillomavirusinfectionamongsexuallytransmitteddiseaseclinicpatientsinHongKong.JMedVirol2002；68：273–7.

[5]Muno?N，BoschFX，deSanjoséS，etal.EpidemiologicClassificationofhumanpapillomavirustypesassociatedwithcervicalcancer.NEnglJMed，2003，348：518-527.

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[7]BouvardV，BaanR，StraifK，etal.Areviewofhumancarcinogens-PartB：biologicalagents[J].LancetOncol，2009，10：321-322.

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[9]乔友林。中国妇女人乳头病毒感染和子宫颈癌的流行病学研究现状及其疫苗前[J].中华流行病学杂志，2007，28：937-940.

[10]王鹤于继云李力.HPV58复合型DNA疫苗抗肿瘤免疫效果的初步效果[J].中华妇产科学.2013，48（7）：523-527.