神经生长因子受体对脂肪源性干细胞增殖的研究

神经生长因子受体对脂肪源性干细胞增殖的研究

金承俊*朱跃坤修有成姚大勇赵维明

（哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外科，哈尔滨150001）

【摘要】目的在体外培养的大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）中检测神经生长因子受体TrkA的表达，为将来ADSCs和NGF联合应用于大鼠压力性尿失禁治疗的动物试验研究提供理论依据。方法分离并培养SD大鼠ADSCs，采用Westernblot方法检测ADSCs中TrkA的表达情况，采用MTT法观察NGF对ADSCs增殖的作用。结果Westernblot实验结果表明，ADSCs中的TrkA表达明显升高。MTT实验结果表明NGF能有效的促进ADSCs的增殖，与空白对照组相比，增值率有显著差异（P＜0.05），且有明显的量效剂量关系。结论ADSCs的NGF特异性受体TrkA表达显著，外源性的NGF能有效的促进ADSCs的增殖。

关键词ADSCs；神经生长因子；Trk-A

女性压力性尿失禁（SUI）虽然不是威胁生命的疾病，但严重影响患者的生活质量和身心健康。随着我国人口老龄化，其发病率逐年上升。随着干细胞与组织工程的发展，利用自体干细胞修复缺损组织为女性压力性尿失禁的治疗提供了新视角。脂肪源性干细胞（ADSCs）以其特有的优势而备受人们的关注。尽管这些干细胞治疗SUI的基础研究及临床试验都观察到一定的疗效与作用，但离真正应用于临床仍有很大差距，其主要原因是植入到膀胱颈及尿道周围的干细胞存活率低，持续时间短，远期效果仍不理想。移植分化的肌细胞神经再支配对于发挥功能是至关重要的，强化移植细胞的神经化，有助于提高疗效。本实验旨在探讨神经生长因子NGF及其受体Trk-A对ADSCs的增殖关系的影响，为进一步应用微环境优化的自体ADSCs移植治疗压力性尿失禁的研究奠定基础。

1.材料与方法

1.1实验材料

取健康S—D大鼠腹股沟皮下脂肪，分离、培养并传代培养大鼠ADSCs。鼠抗TrkA一抗购自武汉博士德生物工程有限公司。神经生长因子(NGF)购自Invitrogen公司。OPTI-MEM无血清培养基购自美国Gibco公司。

1.2实验方法

1.2.1Westernblot方法检测ADSCs中TrkA的表达情况

取对数生长期的ADSCs，加入1ml裂解液裂解细胞，离心，取上清作为细胞总蛋白。取20ug总蛋白样品加入5×SDS上样缓冲液至终浓度，100℃沸水中煮5min使蛋白变性。恒压浓缩胶80V，分离胶120V，时间3h左右，电泳。电泳结束后进行转膜，60V转印4h。转完后将膜用l×丽春红染液染5min。然后用PBS洗涤数次，即可看到膜上的蛋白，根据需要将转印部分进行标记。将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。将一抗用PBST稀释至1:1000，室温孵育1h。PBST于摇床上洗膜两次，每次10min。荧光二抗稀释，室温下摇床孵育1h。孵育结束后PBST洗涤，凝胶成像系统成像保存。

1.2.2细胞增殖实验(MTT法)

将ADSCs培养至第三代，用0.25%胰蛋白酶消化后，接种于96孔板，加入NGF，使其终浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100ng／ml。每个浓度设4个复孔，作用48h。每孔加MTT20l，继续培养4h。弃去上清，每孔加150lDMSO。振荡使结晶溶解，在酶标仪490nm波长读取A值。

1.3统计学方法

用SPSS13.0统计学软件进行统计分析。数值均用均值+/－标准差表示，均数间的比较采用t检验。P<0.05被认为有显著的统计学差异。

2.结果

2.1TrkA在ADSCs中的表达

Westernblot结果显示ADSCs中TrkA蛋白表达明显（图1）。

2.2NGF对ADSCs增殖的影响

对不同浓度NGF与ADSCs作用24小时所测的吸光度(opticaldensity，OD)值采用单因素方差分析(One-WayANOVA)方法进行统计学检验，经方差齐性检验Levene统计量为0.327，P值为0.687，大于0.05，按a=0.05检验水准，认为各组总体方差齐同，采用LSD检验，在6.25ng/ml浓度时NGF对ADSCs的增殖作用统计学意义不显著(P>0.05)，而在(12.5,25,50,100)ng/ml浓度时对ADSCs的增殖具有统计学意义(P<0.05)，且有浓度依赖性。并且12.5、25、50,100ng/mLNGF各浓度之间比较有统计学意义(P<0.05)（表1，图2）。

3.讨论

女性压力性尿失禁是一种给医疗和社会带来严重负担的疾病[1]。压力性尿失禁(SUI)的药物治疗的效果并不令人满意[2]。目前广泛用于压力性尿失禁的尿道周围吊带悬吊术等手术治疗，有时也引起术后排尿困难等并发症且治愈率较低。因此，很有必要寻求一种根本的治疗压力性尿失禁的方法以便达到长期稳固的治疗效果[3]。压力性尿失禁的发病机制是多因素的，包括尿道内括约肌的缺陷和神经损害[4]。因此，针对阻止尿道内括约肌缺陷和促进神经再生使得治疗或修复成为可能。应用ADSCs治疗压力性尿失禁与其他来源的干细胞相比有更大的优势[4]。然而，包括ADSCs在内的干细胞直接注射到尿道周围的移植效果并不理想。研究发现神经生长因子可为干细胞移植提供理想的条件[5]，可以提高移植的有效率。因此本实验研究目的就是为神经生长因子对在体外的ADSCs增殖的作用提供可靠地证据，为将来应用缓释的神经生长因子和ADSCs联合移植于大鼠压力性尿失禁模型尿道周围的实验提供理论依据。

神经生长因子(NerveGrowthFactor，NGF)是最早发现的细胞生长调节因子,也是迄今为止研究的最清楚的一个神经营养因子。神经生长因子在神经元的发育﹑轴突的生长﹑递质的合成及细胞的凋亡等均起着重要作用，它能促进发育中的交感神经元的分化和成熟，维持成年交感神经元的正常功能[6]。早期对NGF的研究主要集中在神经元方面，己明确NGF对神经元的存活、生长发育、分化、再生修复和功能维持起到调控作用。之后的研究发现，NGF除了在神经系统存在，在其它细胞中也有表达，是一种多效能的因子，具有神经系统以外的作用[7]。NGF不仅调控神经元的损伤修复，对肌肉挫伤、表皮损伤、骨折、血管炎等也具有促进愈合的作用[8]。

神经生长因子有两个受体，即高亲和力的TrkA受体及低亲和力的P75受体。研究发现TrkA受体不仅可以调节神经元存活、增殖、分化及凋亡，也表达于多种非神经系统的组织及肿瘤细胞中，以自分泌或旁分泌的NGF为配体相结合，执行多重生物学效应。本研究采用Westernblot检测ADSCs中NGF特异性受体TrkA的表达情况，结果表明，TrkA在ADSCs中高度表达。正因为ADSCs可表达神经生长因子的特异性增殖性受体Trk-A，所以采用体外神经生长因子和ADSCs联合培养的方法来测定ADSCs的增殖情况，结果表明经NGF作用的ADSCs增殖能力显著增高，且呈量效依赖关系。提示NGF/TrkA在促进ADSCs生长分化的过程中发挥重要作用。但神经生长因子对ADSCs的确切增殖分化为具体哪种细胞未作研究。

【参考文献】

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2．RogerRG.What’sbestinthetreatmentofstressurinaryincontinence？NEnglJMed2010；362：2124-2125．

3．CarusoDJ，GomezCS，GousseAE．Medicalmanagementofstressurinary

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4．GimbleJM，KatzAJ，BunnellBA．Adipose-derivedstemcellsforregenerativemedicine．CircRes2007；100：1249-1260．

5．YanagiuchiA，MiyakeH，NomiM，TakenakeA，FujisawaM.Modulationofthemicroenvironmentbygrowthfactorsregulatestheinvivogrowthofskeletalmyoblasts．BJUInt2009；103：1569-1573．

6．PrakashN，Cohen-CoryS，PenschuckS，etal．Basalforebraincholinergicsystemisinvolvedinrapidnervegrowthfactor(NGF)inducedplasticityinthebarrelcortexofadultrats[J]．Neurophysiol2004；91(1)：424-437．

7．LambiaseA，MieeraA，SgrullettaR，etal．Nervegrowthfactorandtheimmunesystem：oldandnewconceptsinthecross-talkbetweenimmuneandresidentcellsduringpathophysiologicalconditions．CurrOpinAllergyClinImmunol，2004，4(5)：425-30．

8．NythiaM，SugnaL，RoseC．Theeffectofnervegrowthfactorontheearlyresponsesduringtheproeessofwoundhealing[J]．BiochimBiophysActa，2003．1620(1-3)：25-31．