1.华北石油总医院神经内科河北任丘062552;2.湖北医药学院第四临床学院湖北十堰442000;
3.渤海石油职业学院河北任丘062552
【摘要】观察应用丁苯酞治疗对急性脑梗死患者血清血管内皮生长因子(VEGF)浓度的变化的影响,并与非丁苯酞治疗的脑梗死患者及正常健康人比较,以期发现血管内皮生长因子在脑梗死患者血液中的变化规律,及丁苯酞对血管内皮生长因子浓度、脑梗死的临床疗效的影响,探索其临床用药的安全性和有效性,揭示丁苯酞改善脑循环的机制,从而完善丁苯酞的药理作用。
【关键词】丁苯酞;脑梗死;血管内皮生长因子;疗效;NIHSS评分
血管内皮生长因子又称血管调理素,是一种内皮细胞特异性有丝分裂原,具有促进内皮细胞增生、转移,增加血管通透性和促进血管生成的作用。丁苯酞是我国具有自主知识产权的一类新药,临床主要用于缺血性脑血管病的治疗,研究表明丁苯酞与传统的抗缺血药物不同在于其作用靶点比较广泛,可作用于多个环节,目前发现丁苯酞具有:①保护线粒体,改善脑缺血组织的能量代谢。②抑制细胞内乳酸脱氢酶的释放,保护神经细胞,降低细胞死亡率。③改善脑循环和脑血流。④抑制细胞内钙离子超载。⑤抗缺血后炎症反应。⑥抗氧自由基产生。⑦保护血脑屏障。⑧降低热休克蛋白(HSP)70mRNA及c-fos的表达。⑨抑制神经细胞凋亡等作用。
本研究目的是观察应用丁苯酞治疗脑梗死患者血清血管内皮生长因子浓度的变化,并与常规治疗的脑梗死患者及正常健康人作对照,比较其血清血管内皮生长因子浓度的变化,以及脑梗死后不同时间点血清血管内皮生长因子浓度的变化,以期发现血管内皮生长因子在脑梗死患者血液中的变化规律,及丁苯酞治疗对血管内皮生长因子变化的影响,揭示丁苯酞改善脑循环的机制,完善丁苯酞的药理作用,并观察丁苯酞治疗脑梗死的临床疗效及安全性。
一、研究过程
(一)研究方法
100例急性脑梗死患者,按入院顺序随机以1:1比例分为治疗组和对照组,中途不能完成实验的剔除,后面进行补充以保证实验人数。对照组50例男性28例,女性22例,年龄55~78岁,平均59.04±6.88岁,大梗死灶10例,中梗死灶23例,小梗死灶17例。常规给予抗凝、抗血小板、保护脑细胞、活血化瘀及对症治疗14天。治疗组50例,男性30例,女性20例,年龄47~79岁,平均58.5±6.25岁,大梗死灶12例,中梗死灶19例,小梗死灶19例。在对照组治疗基础上加用丁苯酞软胶囊0.2g/次,3/d,治疗14天。正常健康对照组30例,男性19例,女性11例,年龄48~67岁,平均57.87±5.15岁。各组年龄、性别分布经齐同性检验后差别无显著性差异(P>0.05),治疗组和对照组在发病时间、病灶部位、体积,神经功能评分及伴随疾病等方面检验无显著性差异(P>0.05),具有可比性。
(二)标本的采集及处理:
全部受试者均于清晨空腹采静脉血6ml,纳入研究的急性脑梗死组患者均于24小时内、3天、7天、14天各抽静脉血6ml,血标本在室温下静置30分钟,3000转离心20分钟,收集血清,分装后于-40℃冰箱保存备检。
1.检测方法:采用双抗体夹心ELISA法进行检测。
2.所用仪器和试剂盒:
Thermo全自动酶标仪,芬兰生产;MULTISKANMK3型洗板机,芬兰生产;-40℃冰箱,海尔公司生产;恒温水浴箱,北京光明医疗仪器厂生产;JingliLD4-1.8高速离心机,北京生产;AE-200精密分析天平,瑞士产;全自动紫外分光光度计,美国PerkonElmer公司;高精度移液器,日本Nichoryo立洋;血管内皮生长因子试剂盒,北京晶美试剂公司。
3.操作步骤(严格按照说明书进行操作):
1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃冰箱保存。
2)标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设5个标准品孔,第一孔中加标准品100μl,再加标准品稀释液50μl,混匀;自第一孔中取100μl液体加到第二孔,然后在第二孔加标准品稀释液50μl,混匀;在第二孔中先取50μl弃掉,然后取50μl加到第三孔中,取标准品稀释液50ul加入第三孔中,混匀;从第三孔中取50μl液体加到第四孔中,然后在第四孔中加标准品稀释液50μl,混匀后从第四孔中取50μl液体加到第五孔,然后在第五孔中加标准品稀释液50μl,混匀后从第五孔中取50μl弃掉。稀释后各孔加样量均为50μl,浓度分别为(480pg/mL,320pg/mL,160pg/mL,80pg/mL,40pg/mL)。
3)加样:分别设空白孔、待测样品孔,后者先加样品稀释液40μl,之后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。
4)温育:用封板膜将各孔封板后置37℃温育30分钟。
5)配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
6)洗涤:揭掉封板膜,然后将液体弃去,甩干,再于每孔加满洗涤液静置1分钟后弃去,如此重复5次,拍干。
7)加入检测抗体:在每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50μL,空白孔除外。
8)温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
9)洗涤:揭掉封板膜,并将液体弃去,然后甩干,并于每孔加满洗涤液静置1分钟后弃去,以上过程重复5次,拍干。
10)显色:在标准孔和检测孔先加入显色剂A、B各50μl,轻轻摇晃混匀,于37℃下避光显色15分钟。
11)终止:于标准孔和检测孔中加终止液50μl,终止反应(此时孔内液体蓝色立转黄色)。
15分钟内在450nm波长处测定各孔的吸光度(OD值)。
4.结果计算:
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在excel表格上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
5.神经功能评分:
采用美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIHSS),分别对病人入院时及治疗两周时进行评分。评分由两名受过专门培训的主治医师同时进行,评分医师不知道患者为治疗组还是对照组,结果取平均分。
6.统计学处理:
应用统计软件为SPSS13.0进行统计分析,实验数据以x±s表示,组内比较采用配对t检验,组间比较采用非配对t检验,以p<0.05为有统计学意义。
(三)结论
1.治疗组和对照组一般情况比较
两组在年龄、性别、高血压病史、糖尿病史、冠心病史、吸烟史、饮酒史、血脂、入院时NIHSS评分等方面差异无统计学意义,具有可比性。
2.脑梗死组血清VEGF与健康对照组比较
在梗死组24h、3d、7d、14d,血清VEGF浓度较健康组均有明显增高(p<0.01),以7d增高最明显,两周时有所下降,但仍高于发病24小时内。
3.对照组和治疗组在不同点血清VEGF浓度比较
24h内两组比较差异无显著性(p>0.05),3d、7d、14d,比较差异有显著性(p<0.01),而以7天时显著性最大(p<0.001)。
4.不同体积梗死灶之间VEGF浓度比较
发病24小时内不同体积梗死患者血清VEGF浓度不同,其中中梗死灶组与小梗死灶组比较血清VEGF浓度明显增高,差别有显著性(p<0.01),大梗死灶组与中梗死灶组比较血清VEGF浓度明显增高,差别有显著性(p<0.01)。
5.对照组和治疗组治疗前后NIHSS评分变化比较
治疗前两组NIHSS评分比较无显著性差异(P>0.05)。治疗后14天治疗组NIHSS评分较对照组明显降低(p<0.01)。
6.安全性分析
治疗前、后两组脑梗死患者行血常规、肾功、肝功、血脂、血糖、电解质等检查,治疗组有1例出现轻微恶心,1例ALT轻度升高(52U/L),其余患者各项实验室检查未见明显异常。
本实验显示,脑梗死后24h血清VEGF含量较健康者已有增加,而在一周内逐渐增高,2周时有所下降,但仍保持在较高水平,与Slevin等研究一致,说明缺血、缺氧的确可以诱发VEGF表达,其动态变化表明VEGF参与了脑梗死的修复过程。不同体积脑梗死血清VEGF含量比较显示,梗死体积越大,VEGF表达越明显,与罗永杰,Slevin报道一致,说明VEGF表达与缺血、缺氧程度呈正相关。
实验还显示丁苯酞治疗后,血清中VEGF含量在各个时间点上均较对照组有明显提高,而且丁苯酞延长了脑梗死患者血清中高VEGF含量的时间。同时实验显示,丁苯酞治疗组治疗前后神经功能改善程度明显好于对照组,说明丁苯酞可以改善梗死区的血液供应,保护脑细胞,促进神经细胞恢复,从而改善临床症状。除众多的已知的作用机制外,丁苯酞促进VEGF表达的功能,在临床疗效方面起到了一定的作用。
本临床实验表明丁苯酞治疗可以明显提高脑梗死患者的VEGF表达而且可以延长其表达时间,神经功能缺损改善方面也明显优于对照组,与动物实验结果一致,说明丁苯酞在人体和动物体内有着相同的作用,同样可以通过上调VEGF的表达保护神经细胞和内皮细胞,促进神经细胞的再生,增加血流灌注从而挽救缺血半暗带的神经组织。
因此可以认为丁苯酞是临床治疗脑梗死安全有效的药物,临床可以推广应用。
参考文献:
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