食源性致病菌快速检测方法研究报告

食源性致病菌快速检测方法研究报告

高友中

高友中（湖南省岳阳县疾病预防控制中心414100）

【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)5-0106-02

【摘要】目的应用酶联免疫吸附实验（ELISA）快速检测奶类及肉类制品中沙门菌。方法样品经增菌后，用ELISA法及国标法对样品中的沙门菌进行初步检测，并比较ELISA法检测结果与国标法灵敏性、特异性、符合率。结果检测200份奶类制品和肉制品，经ELISA法检测阳性率为8.3%，国标法阳性率为6.7%。ELISA法敏感性、特异性分别为100%、97%，与国标法符合率达99.3%。结论ELISA法可快速、方便的对食品中沙门菌的污染情况进行初步检测，灵敏度高、特异性好，与国标法符合率高。适用于食品中沙门菌的初步检测。

【关键词】奶制品肉制品沙门菌ELISA

沙门菌为常见的引起食源性疾病爆发的病原菌，在我国微生物性食物中毒中一直位居首位，而受沙门菌污染的奶、肉制品为造成人类感染的主要来源，因此沙门菌一直为医疗卫生、食品卫生及商检部门重点检验对象之一[1]。本研究采用ELISA法检测奶、肉制品中沙门菌，并与国标法进行比较研究，现报道如下：

1材料与方法

1.1实验材料

奶、肉制品分别来自本市8家不同超市，包括70份奶及奶制品样本，60份肉及肉制品样本。取样均采取随机抽样的方法进行。每份样品250ml或250g，经无菌包装后置冷链保存送实验室检测。

缓冲蛋白胨水，氯化镁孔雀绿增菌液，四硫酸钠煌绿增菌液，亚硒酸盐胱氨酸增菌液，亚硫酸铋琼脂，DHL琼脂，HE琼脂，WS琼脂，SS琼脂，三糖铁琼脂，蛋白陈水、靛基质试剂，尿素琼脂（pH7.2)，氰化钾（KCN）培养基，氨基酸脱梭酶试验培养基，糖发酵管，ONPG培养基，半固体琼脂，丙二酸钠培养基，沙门氏菌因子血清。均按国标相关规定进行。

ELISA相关试剂均购自试剂公司。

1.2实验方法

样品按国标法相关规定预先增菌。样品处理后于36°C培养4h，转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液中，42°C18-24h，另取10ml转种于亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，36°C18-24h。

ELISA法简要步骤如下：特异性抗沙门菌单克隆抗体包被，加入待见样品检测。显色于酶标仪上读取OD值。

国标法简要步骤如下：经增菌后，划线接种于亚硫酸铋琼脂平板和EHL琼脂平板。36°C培养18-24h，观察菌落生长情况。挑选可疑菌落接种于三糖铁琼脂，鉴别反应结果。如出现异常结果，按国标相关规定选择补做甘露醇和山梨醇试验，ONPG等。

1.3数据分析

参考田素娟[1]等的方法进行。即利用检验通用的计算方法，并国标法比较实验的敏感性、特异性、符合率。

2结果

2.1ELISA及国标法检测结果

用ELISA法同步检测份奶、肉制品的沙门菌污染情况，采用国标法进一步验证，结果见表1。

表1沙门菌污染情况检测

2.2ELISA法与国标法敏感性、特异性、符合率计算结果

表2ELISA法与国标法比较

3讨论

3.1常规检测沙门菌方法

目前，沙门菌常用检测方法有：（1）酶快速反应检测技术。包括快速酶促反应显色培养基及自动化微生物分析仪两种方法。VITEKAMS自动微生物检测系统对细菌鉴定是基于细菌的微量生化反应，可鉴定405种细菌。（2）以免疫学为基础的检测技术。包括酶联免疫吸附实验（ELISA）；免疫磁分离技术，如王海明[2]等报道的使用抗沙门氏菌免疫磁珠经增菌后于VITEK全自动生化鉴定仪和荧光PCR分子检测确认；免疫胶体金技术等。（3）以核酸为基础的检测技术，如杨俊超[3]等报道的使用实时荧光定量PCR与常规PCR比较研究，其敏感性、特异性均较好；依赖PCR的DNA指纹图谱技术；随机引物扩增DNA多态性（RAPD）；基因内重复性一致序列（ERIC）的扩增；多重PCR检测技术；NASBA；基因芯片技术等。

3.2本研究采用检测方法

本研究采用ELISA法快速检测奶及奶制品、肉及肉制品中沙门菌的污染情况。其敏感性、特异性较高，且与国标法符合率较高。一般24h之内可以出检测结果。其不足之处在于：（1）不能定量检测沙门菌的含量，只能做定性分析，即是否存在沙门菌污染，但不能测得污染量的大小。后续研究考虑通过设置标准沙门菌对照（蛋白含量已知）的情况下，设立不同稀释度，然后比较样品各组OD值，用统计软件作出标准曲线，进而推算出沙门菌含量。（2）检测结果不太稳定，有可能出现假阳性结果。ELISA实验普遍存在抗体效价下降很快的通病，如不注意保存条件，在反复冻融抗原抗体的过程中，其灵敏度、特异性下降很快。因此本实验要特别注意抗原抗体的保存。严格按照说明书进行。

3.3本研究意义

与其他检测方法相比，本研究具有以下优点：（1）操作简单，对仪器要求不高。ELISA法只需要96孔酶标板及酶标仪即可检测。而其他的方法，比如PCR，VITEKAMS微生物检测系统，均需要大型仪器支持，且操作复杂，对操作人员要求较高。（2）耗时短。ELISA法通常24h即可出结果，如果采用预先包被的方法，检测时间更短，甚至可以缩短至6h左右。这对于临床快速检测沙门菌意义重大。（3）敏感性、特异性高。经前文叙述，本研究敏感性100%，特异性99%，与国标法符合率99.2%。

综上所述，ELISA法应用与快速检测食品中沙门菌有其特定的优势，但同时也存在不足，具体应用何种方法检测需综合各实验室条件及对检测结果相关要求灵活处理。

参考文献

[1]田素娟，徐海燕，王战争等.食品中沙门菌的检测[J].中国卫生检验杂志，2007,17（7）：1244-1246.

[2]王海明，俞晓，金燕飞等.应用磁免疫技术快速检测食源性沙门氏菌方法研究[J].中国卫生监督杂志，2009，16（1）:36-39.

[3]杨俊超，杜亚平，徐德顺.实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测沙门菌的比较[J].浙江预防医学，2009,21（11）：92-93.