HPLC法测定逐瘀通脉胶囊中大黄素的含量

HPLC法测定逐瘀通脉胶囊中大黄素的含量

郑玉梅刘鹏

郑玉梅刘鹏

（哈药集团三精千鹤制药有限公司黑龙江鹤岗154101）

【摘要】目的：研究逐瘀通脉胶囊中大黄素的含量测定方法。方法：用三氯甲烷回流提取，以KromasilC18(4.6mm×250mm,5μ)。以甲醇∶0.1%磷酸溶液（85∶15）为流动相；检测波长为254nm；柱温35℃。结果：阴性样品无干扰，方法专属性良好；在210.2～102μg/ml范围内，大黄素的峰面积与进样量有良好的线性关系，R=0.9999；平均回收率为103.29％，RSD=1.74％；供试品溶液在24小时内稳定性良好。结论：方法快速，简便准确，可用于该制剂的稳定性考察及成品质量控制。

【关键词】高效液相色谱法；逐瘀通脉胶囊；大黄素；含量测定

【中图分类号】R286【文献标识码】B【文章编号】1007-8231（2011）05-0010-02

逐瘀通脉胶囊科学应用虻虫（虻虫素具有强大的清血、稀血功效），水蛭（水蛭素为纯天然特效凝血酶抑制剂）为方中主药，佐以大黄、桃仁协同作用，并采用现代制药技术，使该药同时具有极强的抗凝、溶栓、降脂功效。经动物急慢毒性试验，病理形态学观察，并经过上百例病人的系统观察和近万人的临床应用，证明该药能有效降低血液粘稠度，全面改善心脑血管供血不足状况。其原标准用紫外分光光度法的含量测定方法，参照中国药典2010年版一部和国家药品标准中有关测定大黄的文献资料，考虑到标准方法的易操作性和便捷性，利用HPLC法对本品中大黄的含量测定进行了方法学考察。经方法学研究表明，该测定方法的专属性、线性、精密度、重复性、回收率均良好。

1仪器与试药

对照品：大黄素对照品中国药品生物制品检定所批号110756-200110

仪器：日本岛津全自动高效液相色谱仪，型号：LC-20AT，配备LC工作站

色谱柱：KromasilC18(4.6mm×250mm,5μ)

逐瘀通脉胶囊（哈药集团三精千鹤制药有限公司生产，产品批号为200800501、20080502、20080503）试药：甲醇为色谱纯，其他为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适应性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：0.1%磷酸溶液（85：15）为流动相；检测波长为254nm；柱温35℃。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。

2.2对照品溶液的制备:精密称取经五氧化二磷干燥12小时的大黄素对照品适量，加甲醇制成1ml含20μg的溶液，摇匀，即得。

2.3供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品，研细，取约0.2g，精密称定，置圆底烧瓶中，缓缓加入30%硫酸溶液10ml，超声处理使溶散均匀，在70℃水浴中用三氯甲烷加热回流提取3次（30ml，20ml，20ml。），第一次2小时，第二、三次每次1小时，合并三氯甲烷提取液于分液漏斗中，用适量的水洗涤，分取三氯甲烷液，缓慢蒸干，残渣用甲醇溶解，并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4阴性干扰试验:取不含大黄的阴性样品，照供试品溶液制备方法制成阴性溶液。精密吸取供试品溶液，阴性溶液，对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中，绘制液相色谱图。

A：大黄素对照品;B：阴性对照样品;C：逐瘀通脉胶囊样品由色谱图提示，在对照品色谱峰相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性溶液在此峰位无吸收，对本制剂中大黄素含量测定无干扰，方法专属性良好。

2.5线性试验:精密称取大黄素对照品0.1020g，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，线性试验结果见表1。

表1含量线性试验结果

以大黄素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做回归曲线，回归方程为，y=18792x+8362；R=0.9999，对大黄素在10.2～102μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.6精密度试验:供试品的制备：取经五氧化二磷干燥12小时以上的大黄素对照品7.12mg，置25ml量瓶中，用甲醇稀释刻度。精密吸取1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释刻度，即得。精密量取上述两种溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

以上数据表明，精密度良好。

2.7重复性试验:取逐瘀通脉胶囊样品（批号：20080501），照含量测定项下方法，在同一实验室由同一人进行含量测定，样品6份，按供试品溶液制备方法制备溶液，依法进样测定绘制色谱图。结果见表。

重复性试验结果

由结果可见，测定方法重复性良好。

2.8回收率试验:精密称取供试品（批号：20080501）0.1g，方法同前，再精密称取一定量的大黄素对照品，置于25ml量瓶中，加甲醇制成浓度约为0.162mg/ml的贮备溶液；另精密量取大黄素对照品8.05mg，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取上述两种溶液各10μl注入液相色谱仪，记录峰面积，进行测定。结果见图表

含量回收率试验结果

由结果可见，回收率在95％～105％之间，RSD值为174％。测定方法回收率良好。

2.9供试品溶液稳定性试验:取逐瘀通脉胶囊样品（批号：20080501），色谱条件同前，取本品0.2004g，分别于0、2、4、6、8、24小时，精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录峰面积，进行测定。

结果表明，室温放置24小时，峰面积未发生显著变化,含量测定应在24小时完成。

2.10取10批样品，按上述含量测定项下方法测定含量，结果见表。

含量测定结果

根据十批样品含量测定结果及稳定性研究结果，并结合生产实际，确定本品的含量限度为本品每粒含大黄以大黄素（C15H14O5）计，不得少于0.20mg。

3小结与讨论

取大黄素对照品适量，用流动相溶液溶解，在200～400nm波长范围内扫描，结果大黄素在254nm处有最大吸收，故选254nm作为检测波长。

在试验过程中，曾采用乙腈-水(20∶80)、甲醇-0．3％冰醋酸(75：25)等多种流动相，结果色谱峰分离效果均不理想而未被采用。文中选用的流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）分离效果较好。实验中还考察了不同柱温(10、20、35、40℃)对色谱分离效果的影响，结果各柱温对分离效果、保留时间的影响有明显区别，柱温为35℃分离效果好。因此确定以柱温为35℃。

本课题采用高效液相色谱法测定逐瘀通脉胶囊中大黄主要成分大黄素的含量，具有操作简便，结果准确可靠，重现性好的优点。

参考文献

[1]中华人民共和国药典.化学工业出版社.2010年版,一部.