单克隆抗体免疫分析法的研究进展

单克隆抗体免疫分析法的研究进展

王继平任景文武振芳

王继平任景文武振芳（内蒙古北方重工集团医院药剂科014030）

【中图分类号】R392【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）20-0178-03

【摘要】本文通过查阅近年来国内外有关免疫分析技术的文献，并进行详细研究，对该技术的基本原理、分类及各类方法的临床应用等方面进行了综述。

【关键词】单克隆抗体免疫分析法基本原理方法分类临床应用

单克隆抗体技术(monoclonalantibodytechnique)是一种免疫学技术。1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学奖。1984德国人Kohler、阿根廷人C.Milstein和丹麦科学家N.K.Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理医学奖。

免疫分析法（immunoassay,IA）是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。免疫分析法起始于本世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析。随着分析科学技术的进步和单克隆抗体技术的成熟，二十世纪末药物的免疫学分析技术也得到了极大的发展。单克隆抗体免疫分析法具有亲和力高、特异性强及灵敏度高等特点，提高了药物分析的特异性，促进了药物免疫分析试剂盒的商品化，同时催生了如免疫胶体金试纸条分析法等更简单更快的药物样品筛选新技术及作为简化样品前处理用的免疫亲和微柱研制成功并应用[1]。本文将对4种单克隆抗体免疫分析法的基本原理、分类、特点及临床应用综述如下。

1基本原理

1.1单克隆抗体的制备[1]

单克隆抗体制备技术分为B一淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术和基因工程抗体技术两种，目前药物单克隆抗体的制备仍以B一淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术为主。B一淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术其原理是:B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。采用该技术可制备抗小分子药物的单克隆抗体，整个过程依次为动物免疫、致敏脾淋巴细胞制取、骨髓瘤细胞准备、细胞融合HAT选择性培养、阳性克隆的筛选、细胞克隆、单克隆抗体的收集和纯化.单克隆抗体的特点为理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制及来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并被广泛应用于生物学和医学研究领域。

1.2免疫分析法的原理[2]

本法基本原理是被分析药物（Ag）和标记后的该药物（Ag*）与该药物的特异性抗体（Ab）竞争有限的结合部位，未标记药物（Ag）的浓度决定于标记药物（Ag*）与特异性抗体（Ab）结合的量。标记物可能是放射性同位素、酶、荧光物质或化学发光物质，依据标记物的属性，测定其放射性、酶反应后的UV吸收和荧光强度。

1.2.1放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)[3]

它是将放射性核素示踪的高灵敏度与抗原-抗体反应的高特异性结合起来的一种超微量分析方法,应用于实验分析的核素通常指碘-125(125I)、磷-32(32P)、碳-14(14C)、氚(3H),应用最多的仍是125I。

1.2.2酶免疫分析法(enzymeimmunoassay,EIA)[4]

EIA是在RIA基本理论的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫分析技术。此法的基本原理是在先行结合到固相载体上的抗体或抗原分子上连接酶,进行免疫反应,免疫复合物上结合的酶将特定的底物转化为特定的颜色,用分光光度计测定,由颜色的深浅确定待测物的量。

1.2.3荧光免疫技术(fluorescenceimmunoassay,FIA)[5]

FIA的原理与RIA相同,只是标记物由同位素改成荧光素。荧光素是一种在激光的照射下能发生强烈荧光的物质。荧光免疫分析仪的工作原理是以镧系元素作为荧光标记物，利用这类物质有长荧光寿命的特点，延长荧光时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再进行测定，所得的信号完全为长寿命镧合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰，利用增强液的作用使荧光信号增强使铕离子很容易解离出来生成铕合物，采用脉冲光源，照射物品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测定样品发出的长寿命荧光。

1.2.4化学发光免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay,CLEIA)[6]

本法基本原理是以化学发光物质或酶为标记物，直接标记在抗原或抗体上，先进行抗体-抗原的免疫反应。免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成激发的中间体,形成电子激发态分子,当这种激发态分子回到稳定的基态时，发射出光子，利用发光信号检测仪（如光电倍增管）测量发光强度，根据化学发光标记物与发光强度的关系，利用标准曲线计算出被测物的含量。

2分类及特点

2.1RIA根据反应原理的不同分为放射免疫分析(RIA)和免疫放射分析(IRMA)。其中，放射性核素标记免疫分析技术以抗体作为结合试剂，利用标记物的放大效应，提高了方法的灵敏度及特异性，使免疫分析从定性变为定量、常量分析提高到微量和超微量分析[7]。RIA具有准确灵敏、特异性强、仪器试剂价格低廉、技术成熟等特点,在我国有着较广泛的使用市场和价值。

2.2EIA本法分为异相酶免疫测定和均相酶免疫测定。其中，酶联免疫吸附试验(ELISA)[8]属于前者；酶倍增免疫分析(EMIT)[9]属于后者。随着检验医学的不断发展,一些先进的EIA不断涌现，如斑点-ELISA、发光酶免疫测定、免疫印迹法、BAS-酶联免疫吸附试验等[10]。

2.2.1斑点-ELISA用对蛋白质有极强吸附力的硝酸纤维素膜作为固相载体,酶作用底物后在硝酸纤维素膜上形成有色沉淀而使膜着色。它的灵敏度较一般ELISA高6～8倍、可达ng水平，试剂用量小，不需其他设备条件。

2.2.2免疫印迹法将电泳与ELISA结合起来的一种方法。它的方法分为电泳、转印、酶免疫测定三个阶段。免疫印迹法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样品组分的免疫学测定方法。

2.2.3发光酶免疫测定酶所催化的底物是发光剂，产物具有发光性，可用特定的仪器测定。常用的酶是HRP和AP,HRP的发光底物有鲁米诺及衍生物、对-羟基苯乙酸；AP的底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-(3-磷酸氧基)-苯基-1,2-二氧乙烷和4-甲基伞形酮磷酸盐。

2.2.4BAS-酶联免疫吸附试验将生物素-亲和素(BAS)放大系统与ELISA结合起来的一种技术。亲和素(A)又称卵白素，有4个亚基,都可与生物素稳定结合，此为放大系统的关键,即有1个亲和素就能结合上4个生物素，亲和素也可被酶标记。

2.2.5双特异性McAb一EIJSA[11]在ELlSA中的应用，前者的bsMcAb可特异性的结合玲A和HRP，后者的bsMcA五可特异性的结合巧H碱性磷酸酶。

2.2.6BAS一EIA[12]BAS一EIA技术以链亲合素和酶的结合物作酶标记物，放大系统提高了检测方法的灵敏度。

EIA具有高度敏感性、特异性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，更由于现代生物学技术的发展，使其成为一种适用于各级检验部门的免疫标记技术[13]。

2.3FIA包括时间分辨荧光免疫分析（TRF）、荧光偏振免疫分析、荧光淬灭免疫分析、底物标记荧光免疫分析、荧光增强免疫分析等，但目前应用最多的是荧光偏振免疫分析[14]。采用TRF与其他成熟的技术同时检测某一种物质进行比较，结果显示，TRF的灵敏度要显著高于RIA[15-16]。TRF弥补了FIA分析灵敏度较低的缺陷。

2.4CL包含免疫反应系统和化学发光分析系统。发光分析系统可分为物理发光、化学发光和生物发光,尤以电化学发光免疫分析(ECL)得到较为广泛的应用。方法具有灵敏度高、特异性强、标记物稳定、无放射性污染等特点,但结果不易重复[17]，现已从实验室研究进入常规临床诊断应用。

3免疫分析法的应用

由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使免疫分析的选择性更加突出，所以在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。

3.1RIA的应用

随着放射免疫分析应用的研究进展，放射免疫显像除用于肿瘤的早期诊断外，在其他疾患的应用日趋增多[18]；宋朝锦等[19]采用放射免疫分析方法检测13例经过吗啡单克隆抗体试纸尿液筛选阳性的吸毒嫌疑人的尿液、血液和唾液，结果符合放射免疫分析行业要求；暨南大学第五附属医院采用放射免疫分析法监测了229例地高辛病人的血药浓度，结果表明，地高辛吸收个体差异大,治疗指数低,安全范围窄[20]。

3.2EIA的应用

郭绍丽[21]应用克隆酶免疫分析技术测定地高辛浓度，指导临床科学用药；张书圣[22]提出了对氨基酚（PAP)—H2O2—辣根过氧化物酶(HRP)伏安酶联免疫分析新体系，并成功地应用于人血清中总甲状腺素的测定，检测下限比邻苯二胺显色光度法低5倍；郭大智[23]用自制的试剂建立了检测睾酮、孕酮、雌酮和雌三醇的双抗体酶免疫分析法，初测人和动物的血、奶、尿样品表明所建立的4种测定方法可分别用于人和动物体液中睾酮、孕酮、雌酮和雌三醇的定量检测；Warty等[24]将HPLC与ELISA联用，评估以前Seppak—ELISA法测定血浆中他克莫司母体药物的专属性，结果显示，两法测定的他克莫司血浆谷浓度相近。

3.3FIA的应用

临床用荧光偏振免疫分析对血清中的倍他乐克、阿米卡星、克拉霉素、非洛地平、环孢素A、卡马西平等多种药物进行检测[25]。此外，荧光偏振免疫分析法在毒品检验方面也得到了应用；Kraemer等[26]测定了尿液中的安菲太明及其代谢物的含量,安菲太明的检出限为50μg•L-1，测定结果与GC-MS方法基本一致。

3.4CL的应用

修雁[27]用化学发光免疫分析法和放射免疫分析法同时测定血清中CA19-9的含量并比较实验结果，发现化学发光反应为完全自动，排除了手工加样中人为造成的误差，且无需做标准曲线，既操作方便，又避免了试剂浪费。

4结语

单克隆抗体免疫分析法快速、有合适的灵敏度和专一性，很适合于临床常规用药、药物的多残留等监测，是体内药物分析不可或缺的有力工具之一。随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的免疫检测技术，使单克隆抗体免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。各种免疫标记分析技术将共同存在，快速发展，优势互补，不断地发展和完善，为开发出更新更理想的免疫分析技术提供参考。

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