探讨检测动物源食品中药物残留分析

探讨检测动物源食品中药物残留分析

姚发连

广州汇标检测技术中心

摘要：为进一步监测动物源食品中药物的残留，更好的药物的残留检测方法，利用针对β-受体激动剂的限进型分子印迹整体柱，通过切换阀的组合和在线净化条件的优化，建立了检测动物源食品中克伦特罗和莱克多巴胺残留的在线净化/液相色谱－串联质谱法。样品经酶解和乙酸铵缓冲液提取后，由在线分子印迹柱净化，CAPCELLPAKC18色谱柱（2.1mm×100mm，5μm）分离，多反应监测模式测定，内标法定量。克伦特罗和莱克多巴胺的定量下限分别为0.02μg/kg和0.09μg/kg。在猪肉、牛肉、香肠和奶粉中添加0.05～0.20μg/kg克伦特罗和0.5～2.0μg/kg莱克多巴胺，回收率为84.0%～103.8%，相对标准偏差小于12%。本文检测方法及监测结果进行归纳总结，提出自己的观点，以期提高大家对药物检测方法的重视，建立灵敏的快速检测方法。

关键词：限进型分子印迹柱；在线净化；克伦特罗；莱克多巴胺；动物源食品

一、液相色谱－串联质谱法实验部分分析

1.1仪器与试剂

β-受体激动剂类药物主要用于防治人、畜的支气管哮喘和支气管痉挛，但动物实验表明该类药物同时具有提高饲料利用率和动物胴体蛋白质含量的作用，所以，一些β-受体激动剂，如克伦特罗（Clenbuterol）和莱克多巴胺（Ｒactopamine）常被非法用于畜牧业生产。然而，大量报道显示人们食用含有β-受体激动剂的食品会出现心悸、晕眩，甚至死亡，所以欧盟和我国均禁止在畜牧业生产中使用β-受体激动剂，并制定了β-受体激动剂在动物组织中零检出的限量标准。目前，β-受体激动剂的主流分析技术为液相色谱－串联质谱法（HPLC－MS/MS），与气相色谱－质谱法（GC－MS）、酶联免疫法（ELISA）相比，HPLC－MS/MS无需衍生、灵敏度高、定性定量准确。但HPLC－MS/MS法的前处理技术通常为离线的固相萃取或免疫亲和层析等，面对日益增多的检测样品量和日渐紧迫的检测需求，操作繁琐、耗时的离线前处理模式已逐渐成为整个分析检测的瓶颈。近年来，在线前处理技术以其快速、高通量的特点在环境、生物和医药领域得到了广泛的应用。然而，由于食品基质较为复杂，且违禁药物的检测限量苛刻，如β-受体激动剂类的检测限量低至0.05～0.5μg/kg，所以在线前处理技术在食品（尤其是动物源食品）检测领域的应用相对较少。本文利用针对β-受体激动剂的限进型分子印迹柱对样品进行净化，通过上样、洗脱等条件的优化，建立了动物源性食品中克伦特罗和莱克多巴胺残留量的在线净化/液相色谱－串联质谱检测方法，两者的定量下限分别为0.02μg/kg和0.09μg/kg，整个净化分离检测过程仅需24min，极大地提高了检测效率。

ShimadzuLC20A液相色谱－三重四极杆质谱（日本岛津公司）－API4000Qtrap（美国ABSciex公司），配备3套LC－20AD泵、1套LC－20AB泵和CAPCELLPAKC18（MGⅢ，2.1mm×100mm，5μm，SHISEIDO）色谱柱。Waterse2695液相色谱仪（美国沃特世公司），配备PDA检测器；Ultra－tur-raxT25高速均质器（德国Janke＆KunkelIKA－labortechnik公司），AvatiJ－26XPI高速离心机（美国BeckermanCoulter公司）；乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，德国Merck公司），克伦特罗、莱克多巴胺、D9－克伦特罗（德国Dr.Ehrenstorfer公司），D3－莱克多巴胺（加拿大C/D/NIsotopes公司），β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶（美国Sigma－Aldrich公司）。乙酸铵、冰乙酸（分析纯）。限进型分子印迹整体柱为南开大学制备。实验用水为去离子水。

1.2标准溶液的配制

准确称取10mg克伦特罗和莱克多巴胺标准品，分别置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得1.0mg/mL标准储备液，于4℃避光存放。然后分别取10μL克伦特罗标准储备液和100μL莱克多巴胺标准储备液，混合于100mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，配成混合标准储备溶液（其中克伦特罗为100ng/mL，莱克多巴胺为1000ng/mL），4℃避光保存；D9－克伦特罗和D3－莱克多巴胺分别配制成10ng/mL和20ng/mL的内标工作溶液。

1.3样品前处理

称取样品5g，置于50mL离心管中，添加100μL内标工作溶液，然后加入10mLpH5.2乙酸铵缓冲液，均质提取1min，加入50μL酶。于37℃酶解16h后，12000r/min离心10min，过滤，取1mL上清液，过0.22μm滤膜，待分析。

1.4分子印迹整体柱与液相色谱－串联质谱仪的联接以分子印迹整体柱为前处理柱，与分析柱通过两个六通阀构成二维系统，利用阀切换进行上样、

洗涤、洗脱转移和分析等过程，图1中AB泵和D泵均为二元泵，C泵为单泵。

1.5在线净化－分离以及柱再生条件与质谱参数进样100μL，以0.1mol/L乙酸铵（pH7.0）（A）和5%乙腈水溶液（B）分别洗涤，然后以0.1%甲酸乙腈（C）进行洗脱，同时在分子印迹柱后以0.1%甲酸水溶液（D）对洗脱液进行稀释，在分析柱上以0.1%甲酸水溶液与乙腈（E）梯度分离目标物。体系流速0.5mL/min，其中溶液A和B由AB泵控制，溶液C由C泵控制，溶液D和E由D泵控制，整个在线净化－分离－分析过程如下：0～4min，上样阀位，A保持100%，E保持5%；4～10min，上样阀位，B为100%，E保持5%；10～13min，洗脱阀位，C泵流速0.2mL/min，C为100%，D泵流速0.3mL/min，D为100%；13～16min，洗脱阀位，C泵流速为0，D泵流速为0.5mL/min，E由35%变化为70%；16～20min，清洗再生阀位，C泵流速0.5mL/min，C为100%；20～24min，上样阀位，A保持100%，E保持5%。质谱检测采用ESI+模式，气帘气压力为15psi，喷雾电压5500V，离子源温度600℃，辅助气1和2分别为60psi和50psi，采用多反应监测方式扫描，莱克多巴胺的定量离子对为302/164，定性离子对为302/107，D3－莱克多巴胺的检测离子对为305/167，克伦特罗的定量离子对为277/203，定性离子对为277/168，D9－克伦特罗的检测离子对为286/212，内标法定量。

图1分子印迹柱在线净化/液相色谱－串联质谱检测的阀切换示意图

二、质谱法结果与讨论

2.1提取条件的选择

苯酚型结构的β-受体激动剂（如莱克多巴胺）在组织或者生物样品中往往与葡萄糖苷酶、硫酸酯蛋白结合，因此在样品提取过程中需要进行酸解或酶解。与酸解相比较，酶解过程较为温和，且反应的特异性好，效率高，应用更为广泛。本文涉及同时检测莱克多巴胺和克伦特罗，故选择β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶的混合酶对样品进行酶解处理，pH值、酶解温度和时间均参照Ginkel等的优化结果。

2.2限进柱洗涤时间的优化

普通的分子印迹柱在处理动物源性样品时，基质中的生物大分子（如蛋白及核酸）在疏水性填料表面会发生变性，进而造成填料孔穴堵塞，干扰目标物测定。本文所采用的限进型分子印迹柱，借助孔穴表面的亲水层结构可以有效地阻止蛋白在孔穴表面变性。前期文表明，与非限进型分子印迹柱相比，限进柱上的干扰蛋白可在上样后迅速流出，不对目标物的吸附产生影响。本实验以0.1mol/L乙酸铵为洗涤液，流速为0.5mL/min，进样100μL空白猪肉基质提取液，洗涤整体柱10min，以280nm波长检测样品中的蛋白流出情况，结果（图2）显示，4min后洗涤液中不再有明显的蛋白峰，故0.1mol/L乙酸铵溶液的洗涤时间定为4min。

图2限进型分子印迹柱的蛋白洗脱曲线

2.3洗脱条件的优化

根据分子印迹柱的前期表征，目标物的保留能力随着pH值的下降和溶液中有机相比例的增加而减弱，故本实验采用0.1%甲酸乙腈作为洗脱液。但在线净化检测体系中，直接将高比例有机相的洗脱液引入分析柱会使目标物的峰出现扩散。所以，实验过程中在分子印迹柱后以0.1%甲酸水溶液对洗脱液进行稀释，使目标物可以有效地在分析柱前端富集。为了有效地洗脱目标物，实验以克伦特罗标准溶液测试了洗脱时间的影响。图3A显示，随着洗脱时间增加，克伦特罗的洗脱量逐渐增加，但洗脱时间为4min时目标物的峰形出现分叉（图3B），影响定量分析，故最终选择洗脱时间为3min。

图3洗脱时间对分子印迹柱上克伦特罗保留性能的影响

2.4分子印迹柱的再生

由于分子印迹柱在使用过程中会存在分析物残留的现象，为了不影响下一个样品的检测，进样分离后必须对印迹柱进行充分的洗涤再生。本文在整个分离完成后，切换至清洗再生阀位，以0.1%甲酸乙腈分别洗涤整体柱不同时间（2，3，4，5min）后，再切至上样阀位，以上样溶液平衡。实验结果显示，洗涤4min后，印迹柱上不再有目标物残留，故选择4min作为再生洗脱的时间。

三、液相色谱法--标准曲线与定量下限

实验以空白猪肉基质提取液稀释混合标准储备溶液，其中D9－克伦特罗和D3－莱克多巴胺的浓度分别为0.05ng/mL和0.1ng/mL，得到0，0.025，0.05，0.1，0.2，0.5ng/mL克伦特罗和0，0.25，0.5，1.0，2.0，5.0ng/mL莱克多巴胺的标准系列溶液，进行在线净化/液相色谱－串联质谱检测，以分析化合物与内标物的峰面积比（y）为纵坐标，分析化合物的浓度（x，ng/mL）为横坐标，拟合标准工作曲线。实验结果显示，克伦特罗和莱克多巴胺在上述浓度范围内线性关系良好，其线性方程分别为y=12.1x+0.143，y=3.28x－0.164，相关系数分别为0.9983，0.9968。通过在空白样品中进行加标测定，以提取离子色谱峰的信噪比（S/N）大于10计算方法的定量下限，得到克伦特罗和莱克多巴胺的定量下限分别为0.02，0.09μg/kg，方法的灵敏度可以满足目前国内外对β-受体激动剂残留限量的检测要求。

3.1回收率与精密度

表1猪肉、牛肉、香肠和奶粉基质中添加克伦特罗

和莱克多巴胺的回收率与相对标准偏差（n=6）

分别在空白的猪肉、牛肉、香肠和奶粉样品中添加0.05，0.10，0.20μg/kg3个水平的克伦特罗和0.5，1.0，2.0μg/kg3个水平的莱克多巴胺，以各自的定量离子对进行内标法定量，结果见表1。结果显示，克伦特罗和莱克多巴胺的加标回收率分别为87.0%～103.8%和84.0%～98.9%，相对标准偏差（ＲSD）均小于12%，表明内标法定量的结果较好地校正了基质效应的影响，可以满足分析检测的需要。为猪肉基质中添加0.05μg/kg克伦特罗和0.5μg/kg莱克多巴胺的提取离子色谱图，与空白基质图相比，目标物出峰明显，不存在干扰。

3.2与普通分子印迹柱的比较

为了评价限进型分子印迹柱的特性，对采用相同条件合成但未修饰亲水层的普通分子印迹柱（MIP）和限进型分子印迹柱（ＲA－MIP）分别进行了牛血清蛋白（BSA）排阻回收实验和克伦特罗的定量下限测定实验。从表2的蛋白排阻率结果可以看出，限进型分子印迹柱基本不吸附蛋白，98%的BSA在上样后流出，而普通分子印迹柱则有70%的蛋白吸附在柱填料上。Hagestam等的文表明，蛋白分子的吸附会降低分析物在固定相上的传质效率，干扰目标物的测定。在定量下限测定的比较实验中，添加量相同的样品提取液，经ＲA－MIP柱净化后的克伦特罗响应值高于MIP柱，表2给出了由响应值和噪音计算所得的定量下限，其中克伦特罗在MIP柱上的定量下限（S/N=10）为0.12μg/kg，说明MIP填料上吸附的杂质蛋白对目标物的测定造成了不利影响，MIP柱的净化效果不如ＲA－MIP。所以，从蛋白排阻率和目标物的测定效果分析，限进型分子印迹柱的除杂和分离性能优于普通分子印迹柱。

表2两种分子印迹柱的比较

3.3实际样品的检测

采用本方法对天津口岸进出口的13批次猪肉、10批次奶粉和5批次香肠中的克伦特罗和莱克多巴胺残留量进行测定，根据色谱保留时间和质谱离子丰度进行鉴别，仅有1批次进口猪肉中检出莱克多巴胺（含量为1.2μg/kg），其余样品中均未检出克伦特罗和莱克多巴胺。为阳性样品中莱克多巴胺的提取离子色谱图，中未出现明显的干扰峰，说明限进型分子印迹柱的在线净化效果良好，本文所建立的方法可以满足实际样品检测的需要。

结束语

通过上述分析可以发现，本文利用针对β-受体激动剂的限进型分子印迹整体柱，通过乙酸铵缓冲液提取，阀切换和上样、洗涤、洗脱条件的优化，建立了动物源食品中克伦特罗和莱克多巴胺残留的在线净化/液相色谱－串联质谱检测法。与已有的离线净化方法相比，本方法将繁琐的净化、洗脱转移、重新定容和分离检测等多个步骤简化为一个环节，整个净化－分离－检测过程仅需24min，有效地提高了检测效率，降低了氮吹定容等环节人为污染的风险。本方法适用于猪肉、牛肉、香肠和奶粉中克伦特罗和莱克多巴胺的检测，其定量下限为克伦特罗0.02μg/kg，莱克多巴胺0.09μg/kg，能够满足国内外对克伦特罗和莱克多巴胺残留的检测要求。

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