神经氨酸酶抑制剂合成抗流感病毒药物

神经氨酸酶抑制剂合成抗流感病毒药物

洪兰芳

洪兰芳（佛山市中医院广东佛山528000）

【摘要】近年来，关于神经氨酸酶抑制剂在治疗效果和安全性方面的研究，是针对酶活性位点进行药物设计。本文根据神经氨酸酶抑制剂的结构，活性，结合国内外文献的介绍，合成一种新的神经氨酸酶抑制剂。

【关键词】流感病毒神经氨酸酶抑制剂合成分析

【中图分类号】R978.7【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）14-0040-02

流行性感冒病毒（Influenzavirus,IFV），简称流感病毒，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过飞沫传播，具有极强的传染性。目前临床应用的抗流感病毒药除了金刚烷胺类、神经氨酸酶抑制剂类外，反义寡核苷酸类药物也已进入临床试验阶段[1]。金刚烷胺类药物（金刚烷胺和金刚乙胺）主要作用于甲型流感病毒的M2蛋白，抑制病毒增殖，因此对缺乏M2蛋白的乙型流感病毒无效。此外，金刚烷类药物具有神经系统不良反应及耐药性等问题，也限制其临床应用。神经氨酸酶抑制剂特异性地抑制甲、乙型流感病毒的神经氨酸酶，阻止病毒从感染细胞表面释放，防止病毒经呼吸道扩散，从而起到抗流感病毒的作用，局部效果好，但因口服生物利用度低，且紧用于7岁以下的儿童，对有合并症的流感疗效较差，不是抗流感病毒的理想药物。为此我们尝试合成一种新的的神经氨酸酶抑制剂。

1流感病毒与神经氨酸酶

在流感病毒中，病毒表面有两种糖蛋白[2]：神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)和血凝素(Hemagglutitin,HA)，对流感病毒的入侵和传播起着重要作用。研究结果表明，在动物和人体内两者均能诱导保护性免疫，在功能上各不相同：血凝素抗体具有中和性，可影响病毒与宿主细胞上的唾液酸受体的吸附或影响病毒与细胞膜之间的融合来阻断病毒的感染；NA抗体不具有中和性，能抑制病毒从感染细胞释放或抑制病毒侵染正常细胞。因而NA抗体可降低病毒复制水平，减低肺部病毒滴度，减轻临床症状[3]。

2实验设计路线

2.1神经氨酸酶的结构分析

Stell等在对NA及其衍生物与NA复合物的晶体结构的研究中发现，NA作用的活性位点是高度极性的，有10个Arg、Asp、Glu残基和4个疏水残基(其中Leu135与Tyr406不起作用)，活性区域有5个。此外，比较重要的残基还有Asp151，虽然不属于任一区域，也不与抑制剂直接作用，但在NA催化裂解糖苷键的过程中具有重要作用。由此可见，NA抑制剂的二氢吡喃环上C-2位的羧基、C-4位的羟基和C-6位的亲水性侧链对其与NA的结合非常重要。

C-2位的羧基与NA的S1区域形成盐桥，是活性的必需基团。同时，羧基的存在又增强了抑制剂分子本身的极性，降低了口服给药的生物利用度，只能通过静注或吸入给药。患者使用不便。因此，通常将羧基制成甲酯或乙酯结构。

C-4位的羟基与S2区域的Glu119形成盐桥。Wyatt等[4]对4-胍基构效关系研究发现，4-羟基被胍基取代后，不易产生耐受。1995年，Tiralongo等从SA出发合成了4-胍基SA类似物。其对流感病毒HA抑制活性很高，具有潜在治疗流感的作用。同年，Chandler小组将C-4位胍基改造成N上连接NO2、COOEt、Me、NH2或OH的衍生物，但生物活性均较母体化合物相差很多。1998年，Smith等设计合成了一系列4-烷氨基、氨基或羟基的化合物。研究结果表明：与4-羟基化合物相比，其在该位点形成了1个更强的多原子探针，与NA的结合能力更强。但与4-氨基化合物相比，NA抑制活性相当，甚至更优，说明此类抑制剂并不一定需要通过4-胍基与NA作用。

C-6位的亲水性侧链与NA以亲水作用结合，也是活性必需基团。该侧链具有的C-7、C-8和C-9位的3个羟基，也是近几年研究的热点。Bamford等改造C-6侧链得到了不同链长的SA类似物，活性随羟甲基数目的增多而增大。Smith等研究发现，抑制剂与NA作用的选择性与侧链构型的柔韧性有关。他们合成了一系列6-位为酰胺、醚和酮结构的化合物，并比较了抑制活性。Honda小组通过SA的7-羟基烷基化得到7-烷氧基系列衍生物。活性测定发现，烷基的碳链小于12的化合物对A型病毒NA的抑制活性较强，但除去8,9-2羟基的衍生物活性大大降低，这也说明了8,9-羟基在与NA的结合过程中起到重要作用。当碳链长于12时，抑制活性就显著降低。

2.2神经氨酸酶抑制剂中间体的合成

神经氨酸酶抑制剂中间体[5]，属于抑制嘌呤合成途径的细胞周期特异性药物，化学结构与次黄嘌呤相似，因而能竞争性地抑制次黄嘌呤的转变过程。2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶是重要的医药中间体,是合成神经氨酸酶抑制剂所必须先合成出来的中间体。从它出发可以合成一系列嘌呤及嘌呤衍生物,因此,合成2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶就显得非常重要,其合成方法首先是将氰乙酸乙酯与硫脲在乙醇溶液中缩合环化生成2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶。

3实验设计

3.1实验原理

由于神经氨酸酶抑制剂中间体对流感病毒有很强的选择性治疗作用，结合资料中关于神经氨酸酶抑制剂中间体的合成，纯化等方面，设计合成2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶，通过硝化反应等之后合成神经氨酸酶抑制剂中间体。合成路线如下：

神经氨酸酶抑制剂中间体的合成路线

3.2仪器与试剂

电热恒温水浴锅（型号：S.G.IC-2，上海仪表供销公司）；紫外可见分光光度仪（型号：UV24550）；紫外线分析仪（型号：ZF-I，上海顾村电光仪器厂）；硫脲（重庆化学试剂总厂）；氰乙酸乙酯（中国医药上海化学试剂公司）；乙醇钠（天津光复精细化工研究所）。

3.3方法探讨

3.3.1方法一

分别用天平称取5.0g硫脲和0.5g乙醇钠倒入三颈瓶中，然后加入25.0mL乙醇和7.0mL氰乙酸乙酯，超声粉碎至溶液澄清；然后将三颈瓶放入已经加热至78℃的恒温水浴器中回流，每隔0.5h取样，每次0.5mL，加w＝0.1的盐酸酸化，调pH＝5后经毛细管吸取点样做TLC分析，3.5h反应结束，将生成物用减压蒸馏将溶剂乙醇蒸出，浓缩产物。抽滤，干燥，称重。产率是37.4%。

3.3.2方法二

分别用天平称取5.0g硫脲和0.35g甲醇钠倒入三颈瓶中，然后加入30.0mL甲醇，超声粉碎至溶液澄清；然后将三颈瓶放入已经加热至78℃的恒温水浴器中回流半个小时，再慢慢滴加7.0mL氰乙酸乙酯，每隔0.5h取样，每次0.5mL，加w＝0.1的盐酸酸化，调pH＝5后经毛细管吸取点样做TLC分析，6h反应结束，将生成物用减压蒸馏将溶剂乙醇蒸出，浓缩产物。抽滤，干燥，称重。产率是75.8%。

3.3.3方法三

分别用天平称取5.0g硫脲和0.5g乙醇钠倒入三颈瓶中，然后加入25.0mL乙醇，超声粉碎至溶液澄清；然后将三颈瓶放入已经加热至78℃的恒温水浴器中回流半个小时，再慢慢滴加7.0mL氰乙酸乙酯，每隔0.5h取样，每次0.5mL，加w＝0.1的盐酸酸化，调pH＝5后经毛细管吸取点样做TLC分析，2.5h反应结束，将生成物用减压蒸馏将溶剂乙醇蒸出，浓缩产物。抽滤，干燥，称重。产率是82.5%。

3.3.4TLC展开剂的选择

2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶的相对分子质量是143，氰乙酸乙酯的相对分子质量是113。用不同体积比例的乙酸乙酯和石油醚混合。通过实验比较，结果如下表：

不同体积比混合的结果

结果发现当乙酸乙酯和石油醚的体积比是1:5的时候分离效果最佳。

3.3.5神经氨酸酶抑制剂中间体的合成

用天平称取20g2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶和15mL浓硝酸，搅拌，超声粉碎，倒入三颈瓶中，加热至80℃。4h后反应完成。即得2-磺酸-4-氨基-6羟基嘧啶，产率为86.3%。

将上一步产物溶解于500mL水中，原水中包括10.0gNaNO2和8.0gNaOH，将反应的混合物搅拌过夜，第二天过滤得一种红褐色固体，即2-磺酸-4-亚硝基-5-氨基-6-羟基嘧啶。产率为67.0%。

将所得的4-亚硝基-5-氨基-6-羟基嘧啶在以无水AlCl3做催化剂下，加入10g乙酸，然后加热至75℃后搅拌加热。6.5h反应完毕。得棕红色固体，即2-磺酸-4-甲氨基-5-亚氨基-6-羟基嘧啶。产率为74.5%。总产率为：43.1%。

取上述反应物变成10g乙酰氯，催化剂是无水AlCl3，在加热至75℃，搅拌0.5h之后仍没有棕黄色沉淀产生，于是将温度提高到90℃，继续搅拌，才慢慢析出沉淀。继续反应8h，颜色不得更深，反应完毕。产率为28.6%。

产物2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶用紫外可见分光光度仪的吸收光谱如图：

甲醇钠的紫外吸收光谱

4结果与讨论

实验可知，本第一种方案产率最低，可能是因为氰乙酸乙酯易挥发，跟硫脲直接混匀，没来得及反应就在78℃下已经挥发了相当大的比例，且氰乙酸乙酯有剧毒，故方案一危险性大且产率低，危险系数最高。方案二采用的催化剂是甲醇钠，而氰乙酸乙酯的添加方法改为滴加法，可以在氰乙酸乙酯挥发前就参加反应。避免了氰乙酸乙酯的挥发，使得反应完全。反应时间比方案三长的原因可能是：甲醇钠的碱性比乙醇钠低因而在使硫脲中C=S键的断裂所消耗的能量要比乙醇钠稍稍大些，故反应时间要比方案三长。方案三的产率最高，资源利用率最好，它也采用了慢慢滴加氰乙酸乙酯的方法，使得氰乙酸乙酯充分反应。另外用乙醇钠作为催化剂在最短的时间内使反应进行完全。因而在以后量化合成2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶的时候采用的是方案三，值得注意的是，实验中需家过量硫脲，以保证氰乙酸乙酯完全反应。

实验中得到的2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶的吸收峰在230.1，文献中查出嘧啶环的吸收峰在250-255之间，其中羟基和氨基基团会引起化合物的红移。而且文献中记载关于羟基、氨基所引起的红移量符合。故可以确定所得物质是2-巯基-4-羟基-6-氨基嘧啶。

参考文献

[1]TreanorJJ,HaydenFG,VroomanPS,eta1.Neuraminidaseinhibitoroseltamivirinexperimentalhumaninfluenza.Efficacyandsafetyoftheoralneuraminidaseinhibitoroseltamivirintreatinga-cuteinfluenza[J].JAMA,2000,283:l0l6-l024.

[2]KentaroTakada,YoichiNakao,ShigekiMatsunaga,eta1.Nobiloside,aNewNeuraminidaseInhib-itoryTriterpenoidalSaponinfromtheMarineSpongeErylusnobilis[J].J,2002,65:411-4l

[3]KatiWM,MontgomeryD,CarrickR,eta1.Invitrochar-acterizationofA-3l5675.ahighlypotentinhibitorofAandBstraininfluenzavirusneuraminidasesandinfluenzavirusreplication[J].Aut-umcrobAgentsChemother,2002,46:l014-1021.

[4]GubarevaLV,WebsterRG,HaydenFG.Comparisonoftheactivitiesofzanamivir,oseltamivir,andRWJ-270201againstclinica1isolatesofinfluenzavirusandneuraminidaseinhibitor-resi-stantvariants[J].AntimicrobAgentsChemother,2001,45:3403-3408.

[5]PooranChand,YarlagaddaSBabu,ShantaBantia,eta1.DesignandSynthesisofBenzoicAcidDerivativesasInfluenzaNeuraminidaseInhibitorsUsingStructure-BasedDrugDesign[J].JMedChem,l997,40:4030-4052.