王丹丹崔连东(辽宁省人民医院检验科辽宁沈阳110015)
【中图分类号】R446.11【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2012)18-0057-02
【摘要】目的建立了一种特异性的用于免疫胶体金层析技术(GICA)检测单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的免疫球蛋白IgG。方法共有239份血清和100份全血标本用免疫胶体金层析法进行检测,同时,血清的标本用ELISA方法作对照检测,全血标本分别用ELISA和免疫印迹法(IB)确定。结果与ELISA方法对比,GICA测定特异性的HSV-2抗体的敏感性为100%(69/69,特异性为97.1%(171/176);与HSV-1.轮状病毒和EB病毒抗体的交叉反应分别为2.7%(3/112),2.9%(1/34)和6.2%(1/16);与带状疱疹病毒和人类巨细胞病毒无交叉反应;一定量胆红素、甘油三酯或血红蛋白对该试验无影响;不同的采血方法如毛细管法,EDTA或肝素抗凝的静脉采血法,及血清对实验结果无影响。结论用免疫胶体金层析技术(GICA)检测单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的免疫球蛋白IgG是一种方便、简捷、快速和准确的试验方法。
【关键词】免疫胶体金层析法单纯疱疹病毒ELISA免疫印迹
单纯疱疹病毒(HSV)是一种常见的可引起人类多种疾病的世界范围内的病毒。HSV可分为两种类型:HSV-1和HSV-2。HSV-1通常感染人的舌、口、唇、筛窦和眼,而HSV-2却与人类的生殖道和新生儿的感染相关。HSV可感染不同年龄的人群如新生儿、儿童和成年人。据统计,40岁的人群中,超过90%人血液中HSV-1抗体呈阳性[1]。在美国,大多数的性生活活跃的年轻人均有生殖道疱疹病毒感染[2]。HSV-2的主要传播方式是通过性传播[3]。典型的症状为疱疹性生殖道炎症,其表现为生殖道局部的溃烂,同时可伴随发热、淋巴结炎和尿失禁。有些研究表明85%的原发疱疹性生殖道炎症是由HSV-2引起的[4]。
由于很多的病例无明显的临床症状,因此,要有效地管理疱疹病毒的感染者,用血清学诊断来区分两种类型的病毒就显得尤为重要[5]。这两种类型的病毒的抗原有极高的相似性,然而,它们各自的糖蛋白却有很大的差异,可刺激机体产生不同的特异性抗体,并可用于商业上的诊断产品[6,7]。与蛋白印迹的方法相比,型特异性的血清学诊断方法也可以准确地诊断HSV-1和HSV-2的感染[8]。在临床实验诊断中,HSV-2的特异性血清诊断学方法主要是免疫印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)。这里我们介绍一种简便、快速,灵敏度高和特异性强的免疫胶体金层析技术,用于HSV-2的特异性糖蛋白抗体的检测。
1材料和方法
1.1标本359例临床收集用于检测HSV-1.2抗体的患者血清,其参考的结果是通过ELSIA方法获得。同时,为了研究交叉试验,271份血清检测检测了巨细胞病毒(n=11)、带状疱疹病毒(n=14)、EB病毒(n=16),和轮状病毒(n=34);为了研究干扰试验,在两个HSV-2抗体阳性和阴性的标本中加入甘油三酯、白蛋白、胆红素和血红蛋白,其血清终浓度分别为10mg/ml,60mg/ml、0.2mg/ml和l220mg/ml。为了研究不同的采血方法对胶体金层析法试验结果的影响,100名志愿者,分别用指尖毛细管采血法,EDTA及肝素抗凝静脉采血法和单纯血清采血法采血。试验采用双盲法,作为参考方法,HSV-2抗体检测采用商品ELISA试剂盒检测患者的血清标本。
1.2免疫胶体金层析法当标本中存在HSV抗体时,抗体先与40nm的胶体金结合鼠抗人IgG抗体结合,随着硝酸纤维素膜的层析作用,结合物向前移动。就可以与三个条带上分别标记了HSV-1糖蛋白抗原、HSV-1糖蛋白抗原和羊抗鼠抗体结合,相应的条带就会出现。当测试条带和控制条带均出现时,为阳性;当测试条带未出现而控制条带出现为阴性;仅有测试条带出现或未出现而控制条带未出现,表明检测结果无效。所有检测结果均要求第二个试验人员确认。其示意图如图1
图1免疫层析法检测卡示意图
1.3参考方法用市售的ELISA和免疫印迹试剂盒方法作对照,操作方法严格按照说明书的要求。用相应的检测巨细胞病毒、带状疱疹病毒、EB病毒和轮状病毒的ELISA试剂盒对标本进行检测。
1.4数据评价接受者操作特性曲线(ROC)、似然比、阳性阴性预测值(PPV、NPV)等用MedCalcV9.3.0.0统计软件统计。
2结果
2.1用GICA方法检测血清的结果
在总共359份血清标本中,用GICA法和ELISA法分别检测,有89例HSV-2抗体阳性,阳性率为25.2%(89/359)。两种方法均阳性的为89例;均阴性为257例;有6份标本ELISA检测结果在临界值的范围内。其结果见表1。
表1CIGA与ELISA法检测HSV-2抗体结果
a数据为采用CIGA方法和ELISA方法分别检测359份病人标本和100例健康献血者的标本结果
b指数≥1.1;c指数0.9-1.09(该数据没有统计);d指数小于0.9
确定GICA实验的灵敏度和特异性的受试者工作特征曲线(ROC)见图2.ROC表明,以ELISA法为参考方法,该方法的灵敏度为100%,特异性为98.1%。曲线下的面积(AUC)为0.999。阳性预测值为93.7%,阴性预测值为100%
100%特异性图
图2GICA实验受试者工作特征曲线(ROC)
2.2GICA检测全血的结果为了评价该方法在不同采血方法中的表现,对一些患者3分别用血清、EDTA抗凝血、肝素抗凝血和指尖等采血方法。用GICA对这些标本进行检测,以血清检测HSV-抗体的ELISA方法和免疫印迹方法为对照。均为阳性的为13例,均为阴性的是76例。其特异性和敏感性分别为100%和81.2%。结果见表1
2.3交叉实验结果对HSV-2抗体阴性的170份血清标本,分别用ELISA方法检测巨细胞病毒、带状疱疹病毒、EB病毒和轮状病毒的抗体。然后用GICA法对这些标本进行检测,结果仅有2.4%(4/170)为阳性,结果见表2
表2GICA与ELISA和免疫印迹检测交叉实验结果
2.4干扰实验结果为了研究某些情况下对GICA方法的影响,在两个HSV-2抗体阳性和阴性的标本中加入甘油三酯、白蛋白、胆红素和血红蛋白,其血清终浓度分别为10mg/ml、60mg/ml、0.2mg/ml和l220mg/ml。其结果显示没有干扰。
3讨论
许多泌尿生殖道感染的病例,患者没有明显的症状。确定感染疱疹病毒的类型在诊断、治疗和预防中起到重要的作用[9]。而且,HSV-2感染往往与HIV的感染相关联[10]。近年来,通过对重组的HSV-2糖蛋白研究,已经有检测该病毒特异性抗体的商品化的试剂盒供临床实验室应用。然而,大多数的检测方法耗时,而且需要特殊的设备和技术人员,特别是对于偏远和经济欠发达的地区,不能提供及时准确地的检测结果,以至于延误患者的诊断和治疗。我们研发的这种快速的免疫层析胶体金法,可以弥补这些不足。
实验表明,用免疫胶体金层析法可以快速检测HSV-2的特异性抗体。不同的血液标本,如血清、肝素和EDTA抗凝血、以及指尖血对实验结果均没有影响。作为检测HSV-2抗体的标准方法之一,研究表明ELISA对无症状的患者有较好的应用价值[11]。胶体金免疫层析法与ELISA实验的检测结果对比,也有很高的一致性。而且,胶体金免疫层析法可直接用未稀释的血清标本进行检测,而ELISA法通常要进行1:100倍的稀释后血清。因此,胶体金免疫层析法可能会有较高的灵敏度,特别是对于HSV-2抗体滴度低和抗体的亲和力弱的血清标本。但这种现象,在检测全血标本和指尖采血标本的检测中,表现不明显。通过与检测HSV抗体的标准参考方法如ELISA和免疫印迹法的对比,胶体金免疫层析法有很好的特异性和灵敏度。而且不受血清中的甘油三酯、血红蛋白、白蛋白和胆红素等因素的干扰。
参考文献
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