温冻存羟基磷灰石/骨骨髓间充质干细胞复合植骨材料修复兔桡骨缺损的实验研究

温冻存羟基磷灰石/骨骨髓间充质干细胞复合植骨材料修复兔桡骨缺损的实验研究

马万里张继波孔令菊刘建生郑德宇

马万里张继波孔令菊刘建生郑德宇*(辽宁医学院解剖学教研室辽宁锦州121001)

【中图分类号】R68【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）37-0225-02

【摘要】目的通过深低温冻存自行构建的人工植骨材料修复兔桡骨缺损，探讨深低温冻存方法对保存HA复合植骨材料的可行性。方法应用无菌培养法获得BMSCs与羟基磷灰石HA复合培养，获得复合植骨材料培养构成人工植骨材料。结果BMSCs与多孔HA构建出人工植骨材料，BMSCs在HA表面生存良好。结论低温冻存的复合植骨材料的骨缺损修复能力与新制作的复合材料几乎一致，没有因为冻存而受到影响。

【关键词】骨髓间充质干细胞羟基磷灰石支架材料复合物低温冻存桡骨缺损

1实验材料与方法

1.1实验动物

健康日本大耳白兔15只，2月龄，体重2kg，雌雄不限。

1.2实验方法

1.2.1骨髓间充质干细胞的分离培养和复合植骨材料的构建参见文献10。

1.2.2复合植骨材料的冻存与复苏将培养1周的支架材料复合物移入含有DMEM保存液(10%DMSO，20%FBS的DMEM培养基)的冻存管中，于4℃环境预冷1h后，将冻存管置于-80℃冰箱中保存3个月。3个月后，取出冻存管，快速置于37℃水浴箱中快速复温至保存液完全融化,置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养过夜。将部分标本应用扫描电镜观察BMSCs在HA表面的形态、生长状况。

1.2.3实验动物造模及复合支架移植在无菌条件下分别应用冻存后的复合材料（实验组）、新制备的复合材料（对照1组）和单纯HA（对照2组）修复兔桡骨缺损。术后前3天，连续肌注青霉素80万单位/天，分二次注射。于术后4周处死动物，并进行大体观察、X－线检测和HE染色检测骨缺损修复水平。

1.3统计学分析采用SPSS16.0软件包进行统计学处理，实验数据以均数x±s标准差表示；组间计量资料行配对t检验，P＜0.05为有统计学意义。

2实验结果

2.1HA复合成骨诱导后BMSCs构成的复合植骨材料应用成骨诱导的BMSCs与多孔HA共培养7天后，扫描电位观察BMSCs在HA表面的生长状态。在多孔HA的表面，可见BMSCs伸出了突起，相互接触，彼此连接成片，有的细胞已经伸入到HA的孔隙内。在部分BMSCs之间有丝状纤维连接，在细胞表面也可见到有大小不等的白色钙质颗粒（1B）。复合植骨材料冻存并复苏后，多孔HA的表面及孔隙内的BMSCs的状态与冻存前并没有明显的区别，细胞也没有从HA表面脱落的趋势（1C）。

2.2复合材料原位成骨结果术后所有动物全身状况良好。切口无红肿及渗出液，部分动物术区周围有一定程度的肿胀，虽然未进行特殊处理，这些肿胀也逐渐自行消退。无动物死亡的现象发生。

2.2.1大体观察：在术后4周实验组植骨材料两端均有骨痂生长，断端仍然清晰可见，桡骨及支架材料周围软组织未见充血、变性、坏死表现。其中，实验组和对照1组的支架材料均无移位，对照2组发现有部分标本支架材料可轻微活动。

2.2.2X线观察术后4周：实验组、和对照1组在复合植骨材料与自体骨两端交错，见少量骨痂，断端可见；对照2组几乎未见骨痂，断端清晰（图2）。

图2手术后4周X线片

2.3.3组织学观察术后在材料周围均未发现明显的炎性细胞浸润的情况。术后4周：实验组和对照1组复合植骨材料开始降解，在材料的边缘有大量的类骨质形成。在材料的内部可见有新生的骨岛形成，偶可见小的血管。新骨的形成增多。而对照2组的复合材料内很少见到骨岛形成(图3)。

图3植骨材料的HE染色

讨论应用组织工程的方法可以获得较理想的骨缺损修复材料，但是从组织工程骨的设计到获得能应用的人工植骨材料需要一个漫长的过程，不能满足即刻应用的目的。所以部分研究者和临床工作者开始将目光转向组织工程骨的保存上。虽然临床上有应用冻存自体颅骨骨瓣修复的报道，但对于组织工程骨的报道较少。本实验将骨缺损修复材料在－80℃冻存3个月后，应用冻存后材料修复桡骨缺损，分别于术后4周和12周，通过大体观察，X－线检测和HE染色的方法，可以初步证实冻存后的植骨材料的骨缺损修复效果与新构建的植骨材料的骨缺损修复效果相似，明显优于单纯的HA的骨缺损修复效果。桡骨的最大载荷结果也与上述的实验结果一致，应用冻存后的材料修复的桡骨的载荷与新构建的植骨材料一致。可见应用低温冻存方法可以简单有效的保存HA支架材料复合物。

参考文献

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[2]顾祖超，李起鸿，赵玉峰，等.自体骨髓基质细胞复合支架材料修复兔尺骨干阶段骨缺损的实验研究.中华创伤骨科杂志，2004;6（6）：651～656.

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[5]王伯春.组织工程化骨低温保存研究现状及展望.制冷与空调，2008，22（4）：22～27.