miR-200a在肝细胞癌的表达及其与E-cadherin和β-catenin的关系

miR-200a在肝细胞癌的表达及其与E-cadherin和β-catenin的关系

李荣江冯宇鹏林木平黄振华高峰

李荣江冯宇鹏林木平黄振华高峰

（广东医学院附属西乡人民医院普通外科广东深圳518102）

【摘要】目的：通过检测miR-200a、E-cadherin及β-catenin在肝细胞癌、癌旁组织及正常肝组织的表达，研究其表达与肝细胞癌临床病理特征的关系及意义。方法：采用实时荧光定量PCR检测44例肝细胞癌组织、相应癌旁肝组织以及6例正常肝组织中miR-200a的相对表达量，并应用免疫组化染色法检测E-cadherin及β-catenin在上述组织的表达，分析miR-200a的表达与临床病理参数的关系。结果：miR-200a在肝细胞癌组织中的表达量明显低于癌旁组织(P﹤0.01)和正常肝组织(P﹤0.01)。miR-200a的表达与肝细胞癌的侵袭转移倾向有关。肝细胞癌中miR-200a的表达与E-cadherin呈中等程度正相关关系(r=0.448，P﹤0.01)。结论：检测miR-200a对肝细胞癌术后患者的预后评估具有一定的临床价值。

【关键词】miR-200a；微小RNA；上皮钙黏蛋白；β-连环蛋白；

【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）01-0115-03

1前言

肝癌的临床病理特征是影响肝癌患者术后复发转移和预后的重要因素[1]。MicroRNA(miRNA)是真核生物细胞中一类内源性的非编码小分子RNA，它通过与靶基因mRNA的3'末端非编码区(3'UTR)完全或不完全互补配对，负性调控靶基因的表达[2]。研究发现，miR-200a在多种恶性上皮组织肿瘤[3-7]的表达下调，其表达水平与肿瘤的侵袭转移能力及预后呈负相关[3,8]。本文通过研究miR-200a在肝细胞癌中的表达与患者临床病理特征的关系，分析miR-200a与E-cadherin和β-catenin之间的相关性。

2实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1组织标本

2008年1月~2011年12月于广东医学院附属医院共收集肝细胞癌组织44例，男37例，女7例，年龄23岁~73岁，平均年龄(51.9±11.3)岁；正常肝组织共6例作为正常对照组，男3例，女3例，年龄22岁~59岁，平均年龄(45.7±13.5)岁。根据以下标准将44例肝细胞癌病例分为侵袭转移倾向高危组和侵袭转移倾向低危组，凡符合以下条件中任一项者均归入侵袭转移倾向高危组，否则为低危组：①肝门淋巴结转移；②门静脉有癌栓；③同一肝叶内主癌灶周围肿瘤数目≥2个或有多个小卫星结节或伴有包膜侵袭破坏[9]；本组病例中，侵袭转移倾向高危组27例，侵袭转移倾向低危组17例。根据UICC第六版原发性肝癌TNM分期标准，其中Ⅰ-Ⅱ期30例，Ⅲ-Ⅳ期14例。

2.1.2主要仪器设备和试剂

PCR扩增仪：eppendorfmastercyclergradient，荧光定量PCR扩增仪：ABI7300。trizol试剂购于美国invitrogen公司，OneStepPrimeScriptmiRNAcDNASynthesisKit，SYBR?PremixExTaqTMII，EASYDilution均购于大连宝生物公司。鼠抗人β-catenin单克隆即用型抗体、鼠抗人E-cadherin单克隆即用型抗体均购于福州迈新生物公司。

2.2实验方法

2.2.1实时荧光定量RT-PCR实验方法

表2.1miR-200a和内参U6snRNA的特异性引物序列

基因名称引物序列(5’-3’)Tm(℃)

miR-200acggtaacactgtctggtaacgatgt63.48

U6snRNAtcgcttcggcagcacatatac63.43

Trizol法提取组织总RNA，Poly(A)加尾及反转录反应，以U6snRNA做为内参照，进行实时荧光定量PCR。miR-200a和内参U6snRNA标准曲线斜率之差(M)为0.062﹤0.1。选取一个表达量最小的样本(△Ct值最大)作为对照，应用2-△△Ct法计算miR-200a的相对表达量[10]。

2.2.2免疫组织化学实验方法

采用免疫组织化学实验方法检测E-cadherin和β-catenin。肝细胞癌病理分级根据文献[11]将肝细胞癌分为高分化、中分化和低分化三个等级。免疫组织化学结果判断：根据文献[12]采用半定量积分法对E-cadherin在细胞膜的染色分为三个等级：阳性(+)，弱阳性(±)，阴性(﹣)；β-catenin在细胞质或细胞核的阳性染色细胞数>10%为细胞质或细胞核阳性表达，称为异位表达[13]。对于β-catenin在细胞膜的染色情况则参照上述对E-cadherin的评分方法进行判断。细胞膜的表达减弱或缺失以及异位表达，统称为异常表达。

2.3统计学分析

实验结果采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。由于不同组织miR-200a表达量经正态检验为非正态分布，其表达量采用中位数及四分位数来描述，既M(P25～P75)；配对样本采用Wilcoxon符号秩检验，两独立样本的比较采用Mann-WhitneyU检验；miR-200a与E-cadherin和β-catenin的相关性采用Spearman等级相关分析；P<0.05差异有统计学意义。

3实验结果

3.1实时荧光定量RT-PCR实验结果

3.1.1miR-200a和内参U6snRNA的扩增曲线及溶解曲线。

4讨论

miR-200a属于miR-200家族中的一员。在本实验中，miR-200a在肝细胞癌的表达明显低于癌旁肝组织和正常肝组织，与文献[6]的报道一致。但正常肝组织和癌旁肝组织之间的差异无统计学意义，提示miR-200a在肝细胞癌的表达下调与肝细胞癌的发生发展有关。miR-200a的表达失调在肿瘤侵袭转移过程中起着关键作用，上调miR-200a的表达能够抑制肿瘤细胞的转移，而下调miR-200a的表达能明显促进肿瘤细胞的侵袭和转移[3,4,5,]。本研究证实miR-200a在肝细胞癌侵袭转移倾向高危组的表达量明显低于侵袭转移倾向低危组，表明miR-200a的异常表达与肝细胞癌侵袭转移的恶性生物学行为有关，进一步验证了miR-200a表达下调参与肿瘤侵袭转移的作用。通过检测miR-200a在肝细胞癌组织中的表达水平可能对肝细胞癌患者术后的进一步治疗和预后评估具有一定的临床价值。本实验首次对肝细胞癌中miR-200a和E-cadherin的表达进行相关性分析，结果发现两者呈中等程度的正相关关系(r=0.448，P﹤0.01)。由此推测miR-200a在肝细胞癌中可能通过间接调节E-cadherin的表达而起到肿瘤转移抑制基因的作用，但其具体作用机制还有待进一步研究。

参考文献：

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[8]HuX,SchwarzJK,LewisJS,etal.AmicroRNAexpressionsignatureforcervicalcancerprognosis[J].CancerRes,2010,70(4):1441-1448.

[9]吴力群,卢云,卢华军,等.细胞因子E-cadherin、CD34在肝细胞肝癌患者预后评价中的价值[J].中华外科杂志,2006,44(11):774-777.

[10]LivakKJ,SchmittgenTD.AnalysisofRelativeGeneExpressionDataUsingReal-TimeQuantitativePCRandthe2-△△CtMethod[J].Methods,2001,25(4):402-408

基金项目：

2013年度深圳市科技计划项目立项（编号201303151）