核酸荧光技术测定乙肝病毒的临床意义

核酸荧光技术测定乙肝病毒的临床意义

王惠敏

王惠敏（宁夏固原市人民医院宁夏固原756000）

【摘要】目的：探讨PCR对乙型肝炎诊断临床价值。方法：采用中山大学达安基因股份有限公司提供得核酸扩增实时荧光检验系统DA7600型对住院330例乙肝病毒携带者的血清标本用ELISA法进行定性检测，再用实时荧光PCR定量检测并对其结果进行相关讨论，血清标志物的检测顺序设定为①HbsAg,②HbsAb，③HbeAg,④HbeAb,⑤HbcAb，⑥前SI抗原.结果：“小三阳”组和1.5组阳性组乙肝DNA的阳性检出率以及拷贝数均低于“大三阳”组，且与“大三阳”组有显著性差异（P﹤0.05）,同时前SI抗原的阳性检出率与乙肝DNA的阳性检出率具有很高的一致性，前SI抗原所让与HBV-DNA呈正相关且符合率高，但由于检测成分和表达的意义不完全一致，因此不能等同或代替HBV-DNA的检测。结论：PCR定量测定HBV-DNA可以很好地反映体内乙肝病毒复制和传染性。

【关键词】乙肝病毒；PCR；HBV-DNA

【中图分类号】R512.6【文献标识码】B【文章编号】1007-8231（2011）11-1985-01

乙型肝炎是世界上常见的传染病之一，乙肝病毒携带者约占正常人群的10％－15％，HBV者主要依靠血清标志物乙肝五项来检查发现，但由于检查方法多样性有时候会出现漏检和误检。随着科学技术的不断发展，出现了基因工程学，运用到临床检测乙肝病毒含量，出现了基因扩增检验技术（PCR）。

1对象与方法

1.1标本168份乙肝携带者血青来自本院2008-2至2008-10住院病人。

1.2前SI抗原采用双抗体夹心法。

1.3乙肝血清标志物采用ELISA法检验人五项标志物。

1.4HBV-DNA检验采用荧光定量PCR法测HBV-DNA.

1.5统计学处理技术资料以例数和百分率进行描述。

2结果

2.1330份标本乙肝血清标志物、前SI抗原抗原和HBV-DNA检测结果根据5组不同乙肝血清标志物(HBV-M)标本中前SI抗原和HBV-DNA的检出数，计算出前SI抗原和HBV-DNA相关系数r=0.999,两者呈正的直线相关（t=38.70,p<.01）;前SI抗原和HbeAg相关系数r=0972，两者呈正的直线相关（t=7.165,p<0.01）.见表1。

表15组不同HBV－M、前SI抗原和HBV－DNA检测结果

2.2HBV-DNA与前SI抗原的关系HBV－DNA与前SI抗原检验结果存在相关关系（X2=294.82,p<0.005）,两者检验结果无差异（X2＝0.44，P）0.5）。

3讨论

3.1两种测定方法的应用价值

ELISA测定的是HBVDNA所编码表达的蛋白质(多肽)抗原或相应的抗体。FQ-PCR测定HBVDNA。已知HBV在患者血清中有三种存在形式:球形颗粒、管形颗粒和完整的病毒颗粒(Dana颗粒)。Dana颗粒中含HBVDNA,而球形、管形颗粒不含DNA。不论何种形式的HBV只要其达到一定浓度即可被ELISA检出,而只有当Dana颗粒存在时FQ-PCR才能出现阳性结果。在技术上,FQ-PCR采用荧光标记和闭管检测,克服了常规PCR扩增产物污染所致假阳性的缺点,使结果具有极高的特异性和敏感性。

3.2ELISA与PCR的机制

HBeAg是乙肝病毒内核的主要结构蛋白,是HBV复制和传染性的标志。在本文6例HBeAg阳性标本中,FQ-PCR全部阳性,提示HBeAg与HBVDNA的存在是完全一致的,二者具有相似的流行病学意义。随着HBeAg消失,抗HBe的出现,FQ-PCR的阳性率、HBVDNA的拷贝数均降低,说明抗HBe出现后,病毒的复制减弱,传染性减低;抗HBc不是保护性抗体,单项抗HBc阳性提示机体既往感染或急性感染的“窗口期”。出现这种模式时应作PCR测定HBVDNA以确定该患者处于何种状态。本文6例单项抗HBc阳性标本有1例FQ-PCR阳性,DNA拷贝数2.3×106;抗HBs是重要的保护性抗体,仅抗HBs阳性提示机体感染乙肝病毒后已康复,或接种过乙肝疫苗至今仍有免疫力。在本文测定330例单项抗HBs阳性标本中,有1例FQ-PCR阳性,HBVDNA平均拷贝数2×105;表明虽然抗HBs已经出现,仍有少量HBV复制。在五项指标全部阴性的330例标本中,有2例PCR阳性,HBVDNA平均拷贝数为1×105。产生这种结果的机制是:①病毒感染早期,抗原、抗体尚未形成。②ELISA测定的敏感性低,使低浓度的HBsAg漏检［1]。③患者免疫功能低下,不产生免疫应答或患者出现免疫耐受现象,ELISA无法测定出相应的抗原、抗体。④HBV基因变异,S区变异导致HBsAg抗原性变异,不能被ELISA试剂检出;前C区变异时HBeAg不能表达［2]。160例同时出现两项或三项抗体的标本全部阴性,与文献报道的32%阳性率相差较大,可能是病例选择不同之故［3]。

由以上结果可以看出,FQ-PCR检测定量HBVDNA客观地反映了HBV感染、复制及病程变化,修正或补充了对ELISA测定结果的解释。特别是在病毒感染早期,ELISA不能检测到低滴度的病毒抗原时,FQ-PCR即可检测到HBVDNA的复制,有利于乙肝的早期诊断。对于用干扰素等药物治疗的患者,测定治疗前后病毒核酸的拷贝数,有利于疗效观察及预后判断.

参考文献

［1］杨绍基，任红，主编，传染病学【M】。第7版。北京：人民卫生出版社，2008.24-25。

［2］何华，张大志。乙型肝炎病毒前SI抗原的研究进展【J】.中华肝病杂志，2004，12（12）：765-766。

［3］蔡逸婷，谢松业，丁莉莉。501例HBV感染者血清前SI蛋白抗原检验【J】。解放军预防医学杂志，2003，21（5）：349。

［4］柳长柏，费国忠，姚祯，等。乙型肝炎病毒感染者血清前SI和S2抗原同步检测的临床意义【J】上海医学，1991.49(11);631.