梅毒螺旋体实验室诊断方法及进展

梅毒螺旋体实验室诊断方法及进展

张晓梅王振峰

张晓梅王振峰(江西省上饶市人民医院检验科江西上饶334000)

【摘要】近年来梅毒的发病率正在逐年上升，同时随着免疫学和分子生物学技术的发展，梅毒的实验室检查取得了很大的进展，梅毒螺旋体抗体检测是目前梅毒诊断的主要方法，选快速、准确、特异性及敏感性强的诊断方法，是当前研究的主要热点问题。

【关键词】梅毒检测方法

螺旋体分7个属，其中3个属能引起人类的疾病，分别为密螺旋体，疏螺旋体和钩端体。密螺旋体有三个亚种（1a,1b,1c）1a苍白螺旋体(subsp.pallidum)即梅毒螺旋体［1］。引起严重的性传播疾病梅毒的病原体。

1.梅毒螺旋体检查

1.1暗视野显微镜检查（D-F），不用染色，在暗视野下观察其形态和活动方式，是一种快速直接方法，但对取材要求高，还要注意操作方法的使用和结果的正确解释［2］其敏感性很低，但特异性高，阳性可早期作出诊断。

1.2Fontana镀银染色法，可将螺旋体染成棕褐色，在光镜下易于查见。但与类似梅毒螺旋体的其他物质容易混淆。

1.3免疫荧光染色法（IFA法），用抗梅毒螺旋体抗血清或单身克隆抗体加非致病性螺旋体培养物进行吸收，再与异硫氰酸荧光素结合（FITC）用此方法来染梅毒螺旋体，在荧光显微镜下观察到绿色荧光螺旋体为阳性［3］。其优点是区分梅毒螺旋体与其他条件致病性螺旋体。

1.4家兔感染试验（RabitInfectionTest,RIT）是利用家兔对梅螺旋体注射愧不敢当未成年新西兰白兔睾丸内观察有无感染迹象，但是繁殖慢约30小时才能分裂一次［4］，因此RIT检查时间长，而且费用也高，不适合临床应用，仅适用于科研。

1.5PCR法是较新的方法，现大多数实验室多采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）。FQ-PCR是一种采用PCR结合荧光探针的体外DNA扩增和检测技术；FQ-PCR除了定量准确、有较高的灵敏度和特异性外，还能实时监测并显示PCR的扩增过程，采用封闭的反应系统，有效地降低了实验室污染所造成的假阳性。FQ-PCR检测技术在一期梅毒诊断中有重要的临床价值［5］。

1.6多功能显微诊断仪（MDI）技术，MDI近年来国外开发的一种综合相差对比、暗视野及偏振光的可变投影显微镜，是在高清晰度的情况下连续放大40～15000。其特点是待检标本不需染色及作任何处理，而是将“活的”真实的样本直接进行观察，同时配有显示器、录相机以及彩色激光打印机，可将观察结果同步录相和拍照，具有方便、快捷等优点。MDI用于诊断一期梅毒的阳性率为83.75%［6］。但仪器设备比较昂贵，在各级实验室很难普及推广应用。

2.梅毒螺旋体的血清学试验

临床实验室现大多采用检测血清中梅毒螺旋体抗体（anti-TP）来诊断梅毒螺旋体感染。最早使用的梅毒螺旋体感染诊断的血清学试验是1906年Wasserman建立的补体结合试验，到1920年Kahn又建立了絮状沉淀试验，但这两种经典的梅毒血清学试验因使用的抗原粗制品，操作繁琐，到20世纪60年代以后基本上被实验室所废弃［7］。梅毒螺旋体侵入机体可产生二类抗体，一类为非特异性类脂质反应素抗体，即抗心磷脂抗体，又称反应素，多为IgA和IgM混合型抗体，另一类为抗密螺旋体特异抗体，包括IgM和IgG由于梅毒患者血清中出现的两类不同抗体［8］；因而免疫测定方法根据所使用的抗原分为类脂质抗原血清学试验（非梅毒螺旋体抗原血清学试验）和特异性密螺旋体抗原血清学试验（梅毒螺旋体抗原血清学试验）两大类。

2.1非梅毒螺旋体抗原血清学试验

2.1.1性病研究实验室试验（VDRL），是1946年美国性病研究实验室创建的，故以实验命名之。其原理是从牛心中提取的心磷脂和从鸡蛋黄中提取的卵磷脂及胆固醇等有效成分，梅毒螺旋体在破坏机体过程中可释放一种心磷脂抗原，这种抗原刺激机体产生相应的抗体即反应素，与牛心中提的心磷脂产生免疫结合反应；试验中卵磷脂作用加强抗原性，胆固醇增强抗原的敏感性，试验时出现了在显微镜下或肉眼可见的凝集颗粒或凝集沉淀为阳性，但血清需灭活。VDRL是唯一推荐用于检测脑脊液（CSF）反应素的试验。CSF的VDRL试验对神经性梅毒有重要的诊断价值。

2.1.2不加热血清反应素试验（USR），此方法是将VDRL抗原稀释后，再将该抗原悬液离心，然后在沉淀物中加入含有EDTA-Na2及氯化胆碱和防腐剂的一定量的缓冲液；因此此方法血清无需灭活，但还需显微镜观察结果。

2.1.3快速血浆反应素环状卡片试验（RPR），RPR是在USR基础加上一定量的活性受颗粒，在白色纸片上进行，出现黑色凝集颗粒，肉眼可看见。

2.1.4甲苯胺红不加热血清试验（TRUST），由于甲苯胺红是化学染料，颗粒均匀，生产时批间差异小，结果易于观察，因此，大多数实验室采用TRUST方法筛查梅毒。TRUST试验敏感性为72.5%，特异性为72.0%［9］。

VDRL、USR、RPR、TRUST等该抗体的出现较特异性抗体晚2－3周左右，且随着病情发展，非特异性抗体有增加的趋势，但经有效治疗后，其抗体滴度可以降直至消失，所以非特异性抗体可作为疗效监测［10］。但非特异性抗体容易出现生物学假阳性，应根据临床结合其他试验进行鉴别。

2.2梅毒螺旋体抗原血清学试验

2.2.1荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS），本试验是将梅毒螺旋体Nichols株抗原直接涂在载玻片上，然后将密螺旋体无毒株（Reiter株）制成吸收剂加至待检血清标本中反应30分钟，以去除同属抗原的交叉反应。再将吸收后的血清加到玻片的抗原膜上，37℃温育30分钟，用PBS缓冲液冲洗晾干，再加荧光素标记的抗人IgG，37℃温育冲洗晾干，最后在荧光显微镜下观察结果。本试验敏感性和特异性都很高，有文献报道，FTA-ABS对各期梅毒的特异性达到92.0%，对一期梅毒的敏感性为80%，二期梅毒的敏感性为99%-100%，三期梅毒的敏感性为95%-100%［11］。但价格昂贵，不易于推广。

2.2.2梅毒螺旋体血细胞凝集试验（TPHA），本试验是以梅毒螺旋体作为抗原的间接血细胞凝集试验，操作简便，通常作为梅毒螺旋体感染的特异性验证试验，所用抗原为将梅毒螺旋体Nichols株经超声破碎后得到的可溶性抗原成分，用其致敏红细胞。同时，用Reiter株抗原制成吸收稀释血清，可将血清中的非特异性抗体吸收掉，以加强测定的特异性。

2.2.3梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA），TPPA原理与TPHA相同，不民提TPPA所用的凝集颗粒为明胶，TPPA、TPHA方法的敏感性和特异性都很好，TPPA的敏感性为98.0%，特异性为100%［12］。但是进口试剂价格比较昂贵，且标本需作系列稀释，不利于大批量检测。

2.2.4梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）,此方法的原理是将梅毒螺旋体Nichols株菌体细胞有SDS破碎，再使聚丙烯酰胺凝胶电泳将梅毒螺旋体各种抗原成分分开形成不同区带，经电转印可将这些条带转移至硝酸纤维素膜上作为抗原，最后采用酶标技术检测病人血清中的相应特异性抗体；此种方法优于其他方法，阳性诊断率甚至可达100%。可作为筛查阳性血清的确认实验。免疫印迹法对先天性梅毒的有很高的诊断价值［13］。

2.2.5梅毒螺旋体酶联免疫试验（ELISA），ELISA通过基因工程途径生产重组TP蛋白酶多肽作为抗原将重组TP重组抗原包被在微孔板上，测定患者血清中特异性梅毒螺旋体抗体；具有简单、快速、数据容易保存统计。其特异性与敏感性与TPPA接近，ELISA法与TPPA法的检测结果有较高的一致性，国产ELISA与TPPA的阳性符合率为97.9%［14］。ELISA法是血清学诊断的首选方法，适合大批量梅毒筛查检验。

2.2.6胶体金法，胶体金免疫层析技术是在酶免结合技术基础上发展起来的，胶体金法具有简单、快速，不需任何仪器。但此方法敏感性不高，肉眼判读结果易受主观因素影响，因此临床上很少采用此方法。

2.2.7化学发光免疫分析（CLIA法），化学发光免疫法检测梅毒螺旋体抗体是近年来发展的新技术。化学发光免疫分析原理是采用步法双抗原夹心免疫分析模式，固相载体为聚苯乙烯，使用多种梅毒螺旋体特异性蛋白抗原制备固相抗原，辣根过氧化物酶标记的相同蛋白作为标记抗原，与样品中梅毒螺旋体形成双抗原夹心。经洗涤后加入化学发光底物液，测定其发光强度（RLU），根据临界值判断样本中是否含有梅毒螺旋体抗体。CLIA法敏感性和特异性均很高，CLIA法敏感性为98.4%，特异性为99.8%［15］。CLIA法对弱阳性标本的检测敏感性要高于TPPA法，因此认为化学发光法的敏感性有一定优势，必要时可作为TPPA法的补充实验［16］。CLIA法具有操作实行自动化，数据容易保存等优点，目前，国内大多数大型综合医院采用此方法。

综上所述，为尽早准确地诊断梅毒，选择敏感性、特异性高的方法很重要，目前，临床实验室大多采用ELISA法（或CLIA法）、TPPA、TRUST等同时检测梅毒螺旋体抗体，ELISA法（或CLIA法）用于大批量筛查和确认，TRUST适用于筛查和评价疗效，是否再感染，TPPA对阳性标本的验证实验。这些试验各有其优缺点，随着科学技术的发展，将会出现越来越先进的实验室诊断方法，梅毒的诊断必将变得更准确、快速、简便。

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