痤疮丙酸杆菌促进小鼠外周血中树突状细胞（DC）的动员在体外对胃癌细胞的作用

痤疮丙酸杆菌促进小鼠外周血中树突状细胞（DC）的动员在体外对胃癌细胞的作用

董猛于若卉韩景智刘晓玲崔东晖（通讯作者）

（河北省沧州市中西医结合医院河北沧州061000）

【摘要】目的：探讨痤疮丙酸杆菌促进小鼠外周血中树突状细胞（DC）的动员在体外对胃癌细胞的作用。方法：C578BL/L6J(B6)小鼠注射痤疮丙酸杆菌后分离外周单核细胞，予以流式细胞仪将F4/80-B220-CD11C+细胞，体外加入TNF-α、IL-4、GM-CSF等细胞因子培养，由混合淋巴细胞反应、表型分析、形态学观察鉴定其能否分化为成熟DC；将痤疮丙酸杆菌动员的树突状细胞负载胃癌抗原后致敏细胞，观察体外T细胞活化后对胃癌细胞的杀伤效应。结果：实验组注射痤疮丙酸杆菌后1h、6h、1d、2d、3d、5d、7d后小鼠外周血中F4/80-B220-CDc+细胞变化显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），实验组第1d后显著升高，第3天达高峰后逐渐降低；胃癌细胞与B16细胞相比，痤疮丙酸杆菌动员的DC活化的T细胞及骨髓来源的DC活化的T细胞中IFN-γ干扰素的分泌水平差异有统计学意义（P<0.05）。结论：痤疮丙酸杆菌可对F4/80-B220-CD11C+细胞迅速动员进入小鼠外周血，细胞因子诱导后可分化为成熟的树突状细胞，体外诱导特异性T淋巴细胞杀伤胃癌细胞，同时合并分泌大量INF-γ。

【关键词】实验研究；胃癌；树突状细胞；痤疮丙酸杆菌

【中图分类号】R735.2【文献标识码】B【文章编号】1003-5028（2015）7-0230-02

胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，胃癌除进行化疗及手术外，近年来认为对胃癌患者进行肿瘤免疫治疗临床效果较佳，而其中主要为痤疮丙酸杆菌动员外周血中的树突状细胞，对肿瘤细胞产生杀伤效应，效果确切[1-2]。探析痤疮丙酸杆菌促进小鼠外周血中树突状细胞的动员效应具有重要的临床价值，故本研究探究痤疮丙酸杆菌（p.acnes）促进小鼠外周血中树突状细胞（DC）的动员在体外对胃癌细胞的作用，效果满意，现报道如下。

1资料和方法

1.1实验动物中科院实验动物中心上海分中心提供8-10周龄的雌性BALB/c小鼠及C578BL/6J（B6）鼠。

1.2主要实验仪器及试剂美国BD公司提供的鼠TNF-α、IL-4、GM-CSF、重组鼠干细胞因子（SCF），中科院上海细胞所提供的黑色素瘤B16细胞株及胃癌细胞株SCG-7901，美国Pharmigen公司生产的PE标记的抗Ia、CD8αNCD86单抗、FITC标记的抗CD11b、CD80、F4/80、CD40单抗，FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，鼠DEC-205单抗，异硫氰酸荧光素标记的CD1c单抗，藻红元荧光素（PE）标记的B220单抗，生物素标记的Cy-chrome-conjugatedstreptavidin二抗及F4/80单抗；德国Miltenyi公司生产的结合鼠CD3单抗的免疫磁珠，美国Endogen公司生产的鼠γ干扰素ELISA检测试剂盒。

1.2实验方法1）分离小鼠外周血F4/80-B220-CD11c+细胞：B6小鼠分为八组，每组5只；实验组将灭活的痤疮丙酸杆菌（1mg/100μlPBS）由尾静脉注射，对照组予以PBS100μl注射，在注射前、注射1h、1、2、3、5、7d后小鼠后心脏予以乙醚麻醉，穿刺采集0.8ml外周血，肝素抗凝，外周血单个核心板予以密度梯度离心法分离，细胞标记后由流式细胞仪进行F4/80-B220-CD11c+细胞分离，纯度超过99%；2）观察及表型分析F4/80-B220-CD1c+细胞的形态学：选择注射痤疮丙酸杆菌24h后分选的F4/80-B220-CD1c+细胞，在24孔培养板上接种，加入10ng/mlIL-4及4ng/mlGM-CSF，培养五天后更换新培养板，后用50ng/mlTNF-α及4ng/mlGM-CSF培养五天；培养时每隔2日予以培养基半量换液，用非特异性酯酶和Giemsa染色后光镜下观察；取分选的F4/80-B220-CD1c+细胞，标记后予以流式细胞仪检测共刺激分子DEC205、CD86、CD80及MHC-II。3）混合淋巴细胞反应（MLR）：采集BALB/c小鼠脾脏细胞，应用密度梯度离心法分离MNCs，将结合鼠CD3单抗的磁珠加入后分选，注射痤疮丙酸杆菌24h后的F4/80-B220-CD11c+细胞，将细胞因子及丝裂霉素C（MMC）做相同处理后备用。将刺激细胞及反应T细胞加入96孔板，同时设置单一细胞对照。培养五天后每孔加入MTT继续培养4h离心后除去上清液，加入异丙醇55nm酶标仪检测OD值；4）T效应细胞的诱导、检测IFN-γ：冻融3次的肿瘤细胞悬液离心后，上清液做可溶性抗原，痤疮丙酸杆菌动员的F4/80-B220-CD11c+及骨髓来源的DC经细胞因子培养五日后，将肿瘤细胞抗原加入每系DC，培养2日后收集悬浮细胞则为负载胃癌抗原的致敏DC；制备BALB/c小鼠脾脏T细胞，分别与痤疮丙酸杆菌动员或骨髓来源的致敏DC培养五日，同时加入IL-4及GM-CSF，T细胞活化后为效应细胞，将B16细胞或胃癌细胞加入96孔板每孔内，根据1:1、5:1、10:1、25:1、50：1、100:1的效：靶比加入T效应细胞；培养20h后予以MTT法检测。

1.3统计学处理分析采用SPSS17.0软件系统分析所有数据，计量资料数据采用均数加减标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05则具有统计学差异。

2结果

2.1痤疮丙酸杆菌注射后小鼠外周血中F4/80-B220-CDc+细胞变化实验组注射痤疮丙酸杆菌后1h、6h、1d、2d、3d、5d、7d后的小鼠外周血中F4/80-B220-CDc+细胞变化显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），实验组第1d后显著升高，第3天达到高峰后逐渐降低，见表1。

2.2痤疮丙酸杆菌动员的F4/80-B220-CDc+细胞表型和形态学的分析注射痤疮丙酸杆菌24h后分选的F4/80-B220-CDc+细胞下显示细胞多贴壁生长，少数有突起，较小；流式细胞仪检测细胞共刺激分子DEC205、CD86、CD80、MHC-II低表达，CD40中表达，CD11b高表达，加入细胞因子后，悬浮细胞逐渐增多，产生毛刺状短突起，第0d显示为大多数细胞悬浮，非特异性脂酶染色光镜下观察，细胞表面突起显著增多，形成典型树突状，共刺激分子DEC205、CD80、CD86及MHC-II高表达，与骨髓来源的成熟DC表型一致，见表2。

2.3特异性CTL反应中γ干扰素分泌情况胃癌细胞与B16细胞相比，痤疮丙酸杆菌动员的DC活化的T细胞及骨髓来源的DC活化的T细胞中IFN-γ干扰素的分泌水平(1652.76±42.37)/(124.76±10.65)、(1540.12±36.08)/(40.12±6.08)差异有统计学意义（t=78.21,t=4.53,P<0.05）。

3讨论

本研究探析痤疮丙酸杆菌促进小鼠外周血中树突状细胞的动员对胃癌的杀伤作用，结果显示：实验组注射痤疮丙酸杆菌后1h、6h、1d、2d、3d、5d、7d后的小鼠外周血中F4/80-B220-CDc+细胞变化显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），实验组第1d后显著升高，第3天达到高峰后逐渐降低；注射痤疮丙酸杆菌24h后分选的F4/80-B220-CDc+细胞下显示细胞多贴壁生长，少数有突起，较小[3-4]；流式细胞仪检测细胞共刺激分子DEC205、CD86、CD80、MHC-II低表达，CD40中表达，CD11b高表达，加入细胞因子后，悬浮细胞逐渐增多，产生毛刺状短突起，第10d显示为大多数细胞悬浮，非特异性脂酶染色光镜下观察，细胞表面突起显著增多，形成典型树突状，共刺激分子DEC205、CD80、CD86及MHC-II高表达，与骨髓来源的成熟DC表型一致；胃癌细胞与B16细胞相比，痤疮丙酸杆菌动员的DC活化的T细胞及骨髓来源的DC活化的T细胞中IFN-γ干扰素的分泌水平差异有统计学意义（P<0.05），与牛超,徐建婷等[5]的研究结果大体一致，注射痤疮丙酸杆菌后，外周血中F4/80-B220-CDc+细胞显著升高，与单核细胞十分相似，而体外MLR中刺激异源性T细胞增殖能力较弱，经由细胞因子诱导后，外形上出现典型的树枝状突起，而DEC205、CD86、CD80、CD11c、MHCII类分子高表达，体外出现较强的T细胞增殖能力，DC缺少特异性表面标志，经由功能、表型、形态等方面综合分析确定。综上所述，痤疮丙酸杆菌可对F4/80-B220-CD11C+细胞迅速动员进入小鼠外周血，细胞因子诱导后可分化为成熟的树突状细胞，体外诱导特异性T淋巴细胞杀伤胃癌细胞，同时合并分泌大量INF-γ。

参考文献:

[1]陈彦,汪良,张雁云.痤疮丙酸杆菌促树突状细胞前体细胞动员及其对胃癌的治疗效应[J].江苏医药,2012,32(9):144-145.

[2]肖伟明,吴克艳,龚卫娟,等.胃癌组织中CD1a树突状细胞密度和血管内皮生长因子表达及其相关性[J].中国肿瘤临床,2012,31(21):179-182.

[3]张锦英,束永前,黄普文,等.抗原负载树突状细胞刺激细胞因子诱导的杀伤细胞治疗晚期胃癌的临床观察[J].中国生化药物杂志,2012,26(6):117-120.

[4]林星石,彭正,李力,等.自体树突状细胞诱导TDLN细胞对胃癌细胞系KATO3的体外杀伤作用[J]中国免疫学杂志,2014,20(3):144-145.

[5]牛超,徐建婷,徐东升,等.IFN-α联合GM-CSF诱导胃癌患者外周血单个核细胞分化为树突状细胞[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2013,20(4):143-145.