ZZAP和CDP放散DAT阳性红细胞的效果分析

ZZAP和CDP放散DAT阳性红细胞的效果分析

曹克伟胡小兵

曹克伟胡小兵（周口市中心血站河南周口466000）

【摘要】目的：比较ZZAP和CDP两种放散方法放散DAT(+)红细胞的效果及放散后红细胞吸收自身抗体的能力，为DAT(+)红细胞的抗体放散方法提供依据。方法：收集本站送检的DAT(+)交叉配血标本，选择抗-IgG型与抗-（IgG+C3d）复合型各20例作为研究对象，分别采用ZZAP和CDP两种放散方法进行抗体放散试验，对放散后红细胞分别进行DAT试验；用放散后的红细胞吸收患者自身血浆自身抗体后进行交叉配血试验，评价自身抗体的吸收效果。结果：抗-（IgG+C3d）复合型DAT(+)红细胞用ZZAP和CDP放散效果无差别（P>0.05），ZZAP放散抗-IgG型的效果好于抗-（IgG+C3d）复合型（P<0.05），CDP放散抗-IgG型与抗-（IgG+C3d）复合型的效果无差异（P>0.05）；ZZAP放散抗-IgG型和抗-（IgG+C3d）型复合型DAT(+)红细胞后的抗体吸收效果均好于CDP（P<0.05），ZZAP和CDP放散抗-IgG型DAT(+)红细胞后的吸收效果无明显差异（P>0.05），CDP放散抗-IgG型和抗-（IgG+C3d）复合型DAT(+)红细胞后的吸收效果无差别（P>0.05），ZZAP放散抗-IgG型DAT阳性红细胞后的吸收效果均好于抗-（IgG+C3d）复合型（P<0.05）。结论：抗-（IgG+C3d）型复合DAT(+)红细胞用两种方法均不能很好的解离自身抗体，但对抗-IgG型自身抗体的解离用ZZAP方法好于CDP，提示临床交叉配血实验中对抗-（IgG+C3d）型复合自身抗体最好选盲配血的方法，对抗-IgG型自身抗体用ZZAP进行吸收放散效果较好。

【关键词】ZZAP；CDP；放散试验；自身抗体；AIHA；DAT；红细胞

【中图分类号】R556【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2011）07-0455-03

自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是一类由自身抗体和(或)补体吸附于红细胞表面，导致红细胞破坏增加而引起的溶血性贫血。有报道自身抗体大部分同Rh阳性红细胞有高度亲和性，显示抗体的血型抗原特异性［1］，但临床多认为其具有非特异性。对温反应性自身抗体的分型抗体类型以IgG+C3d型最多（62.96％)，其次为IgG型（20.37％）及C3d型（16.67％），但也有报道发现自身抗体以IgG型多于IgG+C3d型，未发现仅C3d型［2］。AIHA患者中直接抗球蛋白试验（DAT）阳性率高达96%-98%，原因是红细胞的自身抗体或者免疫复合物黏附在红细胞膜上CR1受体引起的［3］，往往给ABO及Rh血型检查和交叉配血造成困难。血库或输血科对这类需要输血的患者进行交叉经常捉襟见肘，如何获得未被自身抗体致敏的红细胞进行血型鉴定和交叉配血就成了难点。为此我们对临床上常用的两种解离温自身抗体的方法木瓜酶/二硫苏糖醇（ZZAP）和磷酸氯喹（CDP）进行放散和吸收效果的对比分析研究，现报道如下。

1对象和方法

1.1研究对象：收集2009年1-12月来自周口市中心医院送检的疑难配血患者血样，红细胞直接抗蛋白实验（DAT）阳性，随机选择经自身抗体分型后抗IgG型自身抗体阳性血样20例，抗IgG+C3d复合型自身抗体血样20例，且均存在交叉配血实验主侧和次测均阳性，排除IgM型冷自身抗体的干扰。

1.2试剂和仪器：抗人球蛋白微柱凝胶卡由Diana公司提供（批号：8139.01），ZZAP试剂由长春博得生物技术有限公司提供（批号：20080508），筛选细胞由长春博得生物技术有限公司提供（批号：20080902），CDP试剂由上海血液生物医药有限公司提供，自身抗体分型卡（抗IgG和抗IgG+C3d）由Diana公司提供（批号：6001.01），微柱凝胶法专用孵育器和专用离心机（Diana公司提供），KUBOTA血清学专用离心机(KA-2200)，普通离心机（80-2）等。

1.3方法

1.3.1ZZAP试剂放散方法：将0.5ml的1％半胱氨酸激活的木瓜酶溶液、2.5ml0.2M二硫苏糖醇、2mlPH6.5PBS混匀调整PH值为6.0-6.5后作为应用液。温自身抗体的自身吸收方法为取两支试管，各分别加1ml压积红细胞，2mlZZAP试剂混合，不时摇动试管，37℃,30min。后用生理盐水洗涤红细胞3次，最后依次彻底除去上清，取少量做DAT，其余压积红细胞加入同体积的血清，混合均匀，37℃吸收30min，然后离心收集吸收后的血清，选用ABO和Rh血型相同的红细胞作为供者，与上述血清用微柱凝胶法进行主侧交叉配血实验以评估患者血清自身抗体的吸收效果。

1.3.2CDP放散法：将DAT为阳性的红细胞，用生理盐水洗涤3次，取压积红细胞0.2ml，加入200ml/LCDP生理盐水溶液0.8mL，在37℃水浴震摇5min，再用生理盐水洗涤3次，取1滴配成50ml/L的悬液作DAT。其余压积红细胞加入同体积的血清，混合均匀，37℃吸收30min，交叉配血实验与1.3.1中相同。

1.4微柱凝胶法阳性结果分级判断：判读标准参照试剂盒说明书。全部细胞都沉积在凝胶的上层则为“4＋”，绝大部分细胞沉积在凝胶的上1/3为“3＋”，绝大部分细胞沉积在凝胶的中1/3为“2＋”，绝大部分细胞沉积在凝胶的下1/3为“1＋”，全部细胞沉积的凝胶的底部为“0”。

1.5吸收放散效果的积分表示法对DAT检测结果和交叉配血后红细胞凝集强度的对比采用Warsh法〔4+（8分)、3+（6分)、2+(4分)、1+(2分)、w+(1分)、O(0分)）积分，用原始患者红细胞DAT检测凝集强度减去用两种放散方法处理后的红细胞进行DAT检测后凝集强度，交叉配血实验后红细胞凝集强度的处理方法同上。对每项样本的积分进行累计，积分越高说明处理的效果越好。交叉配血积分记录结果与上相同。

1.6统计学方法：采用SAS8.1统计软件进行统计学分析，等级计数资料采用秩和检验，P＜0.05及0.01均表示有统计学意义。

2结果

2.1用ZZAP和CDP处理DAT阳性的红细胞后进行DAT检测的结果显示，对含有抗-（IgG+C3d）的患者用ZZAP和CDP处理后无差别（P>0.05），ZZAP处理抗-IgG致敏的红细胞的效果好于抗-（IgG+C3d）（P<0.05），CDP处理抗-IgG致敏的红细胞的效果与抗-（IgG+C3d）无差异（P>0.05），ZZAP处理抗-IgG型抗体好于CDP（P<0.05）。结果见表1.

2.2用ZZAP和CDP处理的红细胞吸收血清后交叉配血结果显示：用ZZAP处理抗-（IgG+C3d）型复合型自身抗体后吸收的效果好于CDP（P<0.05）。用ZZAP和CDP处理抗-IgG型自身抗体吸收效果无明显差异（P>0.05），经CDP处理抗-IgG型自身抗体的吸收效果好于抗-（IgG+C3d）（P<0.05），ZZAP处理抗-IgG型与抗-（IgG+C3d）自身抗体后的吸收血清效果无明显差异（P>0.05）。结果见表2。

3讨论

由温自身抗体引起的AIHA患者，可能遮盖具有临床意义的同种异型抗体，临床工作中常需要进行吸收放散实验，除去温自身抗体以便检测血清中存在的同种抗体，同时可以完成血型鉴定和交叉配血。传统放散试验有热放散法、乙醚放散法、三氯己烯和三氯甲烷法、酸洗脱法、氯仿、ZZAP、CDP等，热放散法主要用于寒冷型抗体(多为大分子IgM)，乙醚放散法主要用于放散Rh血型和温反应性抗体，氯仿能同时放散IgG和IgM性质抗体，但使红细胞本身蛋白质严重变性，其他机溶剂放散法会破坏致敏红细胞，只能收获到被解离的自身抗体，不利于吸收试验和后续的交叉配血，而不破坏红细胞的放散方法常用的有ZZAP和CDP。当包被了IgG分子的红细胞用ZZAP处理后，IgG分子失去了完整性，并从红细胞膜上解离下来，蛋白酶可增加处理后红细胞的抗体吸收能力，CDP放散法是应用最多的放散方法，其能保持红细胞膜的完整性和抗原活性［4］。有报道用CDP放散实验能将吸附在红细胞表面的抗体放散下来，并可得到正确的血型正定型结果［5］，而且红细胞膜上的血型抗原无明显丢失［6］，但CDP方法处理红细胞需37℃孵育30min以上，会增加红细胞溶血，同时加速红细胞老化，部分细胞膜丢失，红细胞M、JKa、JKb、Do等抗原强度下降［7,8,9］,也有报道CDP可使Bg抗原从红细胞上脱落［10］。ZZAP也可以破坏一些血型系统的抗原有K、M、N、Fya、Fya、S、s，以及LW、Gerbich、Cartwright、Domgbrok和Knops系统抗原，因此用此放散方法用于同种抗体的鉴定要注意。

临床对DAT阳性的患者，由于自身抗体包被在红细胞上，血清中存在游离的自身抗体，导致DAT和IAT阳性，主侧、次测交叉配血不合，给输血工作带来了困难。如果不对患者红细胞进行吸收放散，就无法完成主、次测交叉配血试验。因此临床要应用红细胞自身抗体放散的方法解离结合到红细胞上的自身抗体，从本试验的结果显示，对复合型抗-（IgG+C3d）的患者用ZZAP和CDP处理后均不能很好的解离结合到红细胞上的自身抗体，但对抗-IgG型自身抗体用ZZAP的效果好于CDP，用ZZAP均好于用CDP处理自身抗体致敏的红细胞。两种方法处理的红细胞吸收血清后，用ZZAP和CDP处理抗-IgG型自身抗体后的红细胞吸收自身抗体的能力无明显差异，说明两种方法均能很好的用于处理抗-IgG型自身抗体引起的致敏红细胞，经CDP处理后抗-IgG型自身抗体的红细胞的吸收的效果好于抗-（IgG+C3d），ZZAP处理抗-IgG型与抗-（IgG+C3d）自身抗体后交叉配血无明显差异。鉴于对复合型自身抗体两种方法处理致敏红细胞，均不能很好的解离，因此建议临床对有DAT阳性的血样，应进行自身抗体分型，但是并不是只有AIHA有DAT阳性，很多疾病如慢性肝炎、肝癌、SLE和慢性阻塞性肺疾病等等，有时其红细胞的DAT也出现阳性，为了区别DAT是否由于红细胞的真正抗体引起，有必要对DAT进行类型鉴别，各型抗体造成红细胞破坏的机制不同［11］，一般IgG+C3d型的贫血和溶血程度都较IgG型和C3d型为重，而IgG型、C3d型者贫血及临床症状较轻［12］，这证实了型别与疾病严重程度相关联［13］。可见对自身抗体分型有利于临床对AIHA的认识和早期诊断和指导输血科/血库对进行交叉配血和输血指导。如果为复合型自身抗体，建议无需进行放散吸收试验，按照盲配原则进行交叉配血实验，选择反应强度最弱的血液作为供者，并建议临床输注洗涤红细胞，对首次输血者每次输1U，24h内不超过2U，不主张对Hb>40g/L的患者输血，只有采用激素治疗病情缓解后可以加大输血量。而对于抗-IgG型自身抗体阳性的患者，为防止有其他同种抗体的并存，应采用ZZAP或者CDP方法对患者红细胞进行放散，用放散后的红细胞再吸收患者血浆中存在的抗-IgG型抗体，并用放散后的红细胞和吸收的血清进行交叉配血实验，来进一步鉴定是否并存有同种抗体和完成交叉配血，以保证输血安全。

参考文献

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［13］朱建云，龚长如.自身免疫性溶血性贫血的免疫分型及临床分析［J］.临床和实验医学杂志，2007，6(9):107-108作者简介曹克伟（1970-），男，河南周口市，本科，研究方向：输血检验，职称：主管技师。