应用荧光PCR技术和细菌培养法检测孕妇产前B族链球菌感染的对比分析

应用荧光PCR技术和细菌培养法检测孕妇产前B族链球菌感染的对比分析

刘睿崔坤友刘文彬李珍宇

刘睿崔坤友刘文彬李珍宇

(东莞市清溪医院检验科广东东莞523660)

【摘要】目的对比观察荧光PCR技术和细菌培养法用于产前筛查B族链球菌（GBS）感染的检验效果。方法收集500例孕34-37周孕妇阴道肛门拭子，分别进行GBS核酸检测（PCR）及细菌培养检测，对比两种方法的阳性检出率、敏感性、特异性、准确性。结果500例样本中，PCR技术检测GBS阳性43例，阳性率8.6%，细菌培养法检测GBS阳性26例，阳性率5.2%，差异有显著性（P<0.05）；与测序法对照，PCR技术正确占89.5%，细菌培养法正确占10.5%，差异有显著性（P<0.05）；PCR技术与细菌培养法的敏感性、特异性分别为100%、99.6%和61.0%、99.8%，二者敏感性差异显著（P<0.05）。结论产前B族链球菌检测，PCR技术明显优于细菌培养法，其阳性率高、准确性大、敏感性好，检测速度更快。

【关键词】实时荧光PCR细菌培养B族链球菌围产期阳性率敏感性准确性

【中图分类号】R714.14【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）08-0198-02

B族链球菌（groupBStreptococci,GBS）是围产期感染的重要病原菌之一，对围产期GBS进行临床筛查尤为必要[1]，我院从2012年起应用PCR技术进行GBS检测。本研究旨在同时进行PCR技术与细菌培养检测，对比观察GBS检测的阳性率、准确性、敏感度。

1.材料和方法

1.1实验样本

收集2012年8月-2013年12月，孕35-37周来院检查的孕妇阴道直肠拭子500例，入选人群无感染性疾病，取样一周前未使用青霉素及其他抗生素。严格按照取样流程，同时采集两份标本，分别进行GBS细菌培养和应用PCR技术进行核酸检测，48小时内检测完毕。

1.2试剂、方法和仪器

1.2.1细菌培养方法：将拭子上的细菌接种于5%羊血培养基中（接种时菌液在培养皿应尽量均匀地涂开），在37℃培养箱内进行24小时培养后，由菌落形态、溶血特性、显微镜下所见及生化反应可以确定链球菌，再采用族和型特异性血清进行免疫试验最后确定为GBS。

1.2.2PCR方法：采用福建泰普生物科学技术有限公司B族链球菌核酸检测试剂盒（国食药管械（准）字2001第3400250号），仪器为LC480ⅡPCR仪（罗氏公司），本院PCR临床实验室经省临检中心验收合格。

标本处理：标本登记后4℃冰箱保存，检测前在拭子管中加入清洗缓冲液1ml，高速震荡2min，得到标本悬浮液；13000r/min离心5min，弃上清；再加1ml清洗缓冲液，13000r/min离心5min，弃上清，沉淀用100ul清洗缓冲液重悬，加入提取固形物，高速震荡5min破碎细胞，95℃干浴2min，立即冰浴5min，13000r/min离心1min，上清用于扩增。所有开盖操作在B2级生物安全柜中进行。

标本检测的其余操作步骤和PCR反应条件按说明书进行。GBS阳性判断标准：FAM荧光信号有明显S形扩增曲线，CT值小于33，TexasRed(内参)CT值小于40，且本批实验阳参、阴参检测结果符合预期。

1.2.3测序法作为对照统计两种方法的敏感性、特异性、准确性。PCR法和培养法检测同时阳性或同时阴性则实验通过，如两种方法结果不一致，则扩增后进行测序验证结果。

1.3统计学分析统计学处理由SPSS11.0软件包完成，采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学显著性意义。

2.结果

2.1500例孕妇中，PCR检测检出GBS阳性43例，阳性率8.6%；细菌培养检出GBS阳性26例，阳性率5.2%；两种方法同时阳性25例，同时阴性456例；PCR（+）/培养（-）18例，PCR（-）/培养（+）1例。PCR法与细菌培养法阳性率比较有显著性差异（P<0.05），见表1。

2.2将19例荧光PCR法与细菌培养法结果不一致的样本用测序法鉴定后结果：

1）PCR（+）/培养（-）的18例标本测序鉴定为B族链球菌序列的为16例，非B族链球菌序列的为2例。

2）PCR（-）/培养（+）的1例标本测序鉴定为非B族链球菌序列。荧光PCR法正确占89.5%，细菌培养法正确占10.5%，二者有显著性差异（P<0.05），见表2。

2.3500例样本中PCR与细菌培养检测对照测序法的性能比较，PCR法与细菌培养法检测敏感度有显著性差异（P<0.05），特异性相当，见表3。

表1500例样本实时PCR检测与细菌培养阳性率例数（百分比）

与细菌培养法比△P<0.05）敏感性有显著差异；★P>0.05，特异性无差异

3.讨论

GBS为革兰氏阳性球菌，已被证实为围产期母婴感染的主要致病菌之一，在围产医学中具有不可忽视的地位[1]。GBS位于下消化道及泌尿生殖道，以母婴垂直传播方式传染给婴儿，GBS感染导致了产褥感染和新生儿感染，是导致胎膜早破、早产的重要因素[2]。新生儿感染GBS通常都是早期发病，临床表现为败血症、肺炎和脑膜炎等，致残致死率较高[3]。早期合理使用抗生素可以有效控制GBS感染，因此及时发现并治疗GBS感染，对减少母婴发病极其重要。

目前公认的检测窗口为孕35-37周阴道肛门同时取样[1]。以前临床上用的GBS检测方法基本为培养法，首选SMB或Lim肉汤选择性培养基，由菌落形态、溶血特性、显微镜下所见及生化反应可以确定链球菌，采用族和型特异性血清进行免疫试验可最后确定GBS[4]。荧光PCR法为一种有效的、快速的临床病原微生物检测方法，利用不同种属的特异性核酸序列设计引物，不同荧光染料标记探针，结合高通量的检测仪器，可以实现快速、灵敏、高通量的闭盖检测，快速准确，敏感度高。本研究结果显示，PCR法检测GBS阳性率、准确性、敏感度明显优于细菌培养法，且非常快捷，能及时指导医生干预治疗以预防母婴传播，也有助于保证那些刚刚开始分娩或尚未得到合理产前保健的感染孕妇及时预防性抗生素治疗，是孕妇产前筛查GBS感染的理想方法。

参考文献

[1]RevisedguidelinesfromCDC,2012.PreventionofperinatalgroupBStreptococcaldisease[R].MorbidityandMortalityWeeklyReport(MMWR),2010,59(RR-10):1-32.

[2]何国才，白清，李高，妊娠晚期孕妇B族链球菌感染的研究状况[J].医学综述，2012，18（14）：2255-2257.

[3]陈慧慧，范建霞，围产期B族链球菌感染的研究新进展[J]，中国妇幼健康研究，2009，20（3）：343-345.

[4]马延敏，吴连方，B族链球菌对母婴健康的影响及诊断和防治[J]，中华围产医学杂志，1998，1（2）：109-111.