miRNA-145在粥样硬化性颈动脉狭窄早期诊断机制研究

miRNA-145在粥样硬化性颈动脉狭窄早期诊断机制研究

袁衡董利萍罗文奇张晓东刘冠兰*

（长沙医学院，湖南省长沙市410000）

摘要：颈动脉狭窄是局部血管狭窄，超过正常血管直径的50％的一种病理状态。据报道，在50岁以上的美国人群中有约5％的发病率，每年有70，000例颈动脉狭窄手术。因此，对于颈动脉狭窄发生和成熟的病理生理机制的研究将极大的有利于对该疾病的治疗。颈动脉狭窄的病理学改变很多，较常见的表现为动脉中层弹力蛋白基质结构的破坏，平滑肌细胞减少和炎症细胞的浸润。动脉狭窄血管壁随着疾病的进展发生血管外膜重构和纤维化而变厚。目前认为动脉粥样硬化以及尚未揭示的基因成分等复杂的相互作用引起的。病理学研究提示，动脉壁基质金属蛋白酶(MMPs)的蛋白水解，动脉壁的炎症和氧化应激可能是最主要的致病机制。

关键词：miRNA-145；粥样硬化性颈动脉狭窄；早期诊断

动脉粥样硬化（AS）是血管疾病的病理基础，AS病变形成后是否导致临床症状的出现，更重要的是斑块本身的性质是否稳定，是否有血栓形成等继发病变。颈动脉粥样硬化斑块破裂或表面破损，是引发颈动脉狭窄的主要原因。粥样斑块核心的组成和体积、纤维帽的强度、单核巨噬细胞等炎性细胞的浸润情况等决定了粥样斑块本身的性质[1]。

一、样本收集

收集2016年9月至2017年12月间，湖南省中医院住院粥样硬化性颈动脉狭窄患者术前外周静脉血标本39份，将血标本离心后吸取血清置入冻存管内保存于-80℃超低温冰箱中，用于后续研究；另外收集16例正常体检人群的外周静脉血，离心收集血清作为非粥样硬化性颈动脉狭窄对照组。纳入本研究的粥样硬化性颈动脉狭窄患者共计39人，男23人，女16人，年龄（58.04±9.15）岁，既往无肿瘤和其他遗传疾病史，术前常规检测无特殊，术前均未进行放射和化学药物治疗，术后标本均经病理检验证实为粥样硬化性颈动脉狭窄。所有患者均自愿加入并签署知情同意书。

二、miR-145的临床验证

对收集的病人血样按照ambion公司提供的RT-PCR试剂盒进行操作，验证miR-21在临床标本中的表达。miR-145引物序列：'F:5'-AGGCTGTGAAGCTCTCCCCACT-3',

R:5'-GCCACACTGCTGCCTTTTAGTCCC-3'。GADPH探针序列：

F:5'-ACGCCTCTGGCCGTACCACT-3'，R:5'-TGGTGAAGCTGTAGCCGCGC-3'。

三、miR-21临床表达结果

共收集到39个病人的血样，16个正常人血样，分成病例组和正常组进行RT-PCR检测，得到的miR-145相对表达含量如图1所示，miR-145在病例组中表达含量明显高于正常组。

四、组织形态学上不稳定性斑块即易损斑块（VP）的特点

在组织形态学上不稳定性斑块即易损斑块（VP）有以下特点：（1）具有偏心的、相对体积大且质软的脂质核心；（2）斑块内有大量炎症细胞聚集；（3）纤维帽薄弱外形不规则；（4）斑块内有大量新生血管。VP破裂可以是由于斑块性质变化而自发的，也可能在如过度的体力活动、情绪激动及急性感染等多种促发因素作用下发生。斑块破裂时斑块的纤维帽（多在斑块的肩部）撕裂，斑块粥样核心内的大量脂质进入动脉管腔，这些脂质具有高度致血栓作用，存在于斑块及内膜下层的胶原是最强的血小板激活剂之一，所以斑块破裂后迅速继发血栓形成并引发多种临床症状。深入研究影响动脉粥样硬化斑块稳定性的因素及其机理，寻找稳定斑块预防斑块破裂的策略和方法对降低动脉粥样硬化病的致残致死率有至关重要的意义[2]。

五、微小RNA概述及应用

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类约有18-24个核苷酸的非编码小RNA分子，它可在基因转录后水平上，靶向一个或多个mRNA，诱导的基因沉默复合物结合后，以完全或不完全配对与靶mRNA结合，引起靶基因mRNA的降解或翻译抑制，在转录后水平调控基因表达，进而调节机体的基本生物学过程，包括调控细胞分化、生长、增殖、代谢、凋亡等功能[3]。

目前估计miRNA能调控哺乳动物大约30%蛋白编码基因，肿瘤中的miRNA通过调控靶基因参与的信号通路，影响肿瘤的发生和发展，甚至侵袭转移，发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能。miRNA的表达具有肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性等三个特点。研究发现，在血管平滑肌细胞受损时，外周血单核细胞、T淋巴细胞等被视为关键的效应细胞，已证明这些细胞miRNA的失调，有加重炎症、降解细胞外基质以及侵袭居留细胞的作用，经成为颈动脉狭窄研究中的热点和亮点。AS病变的发生发展牵涉的过程包括内皮细胞的活化、单核细胞的浸润、泡沫细胞的形成、平滑肌细胞纤维帽的形成、最终的斑块破裂等，已经发现多种miRNAs可调控这些过程的关键基因：参与内皮细胞和单核细胞致炎过程如miR-146；参与巨噬细胞成熟如miR-146、miR-124；参与胆固醇生物合成如miR-33；参与斑块内血管新生如miR-92a、miR-15b、miR-16、miR-20a、miR-200；参与SMC增殖如miR-221/222因为miRNAs对易损斑块及斑块破裂的潜在作用，基于miRNA的诊断与治疗研究已经成为研究人员的“新宠”[4]。作为调控基因表达的重要分子，miRNAs调控在AS斑块中细胞的作用机制研究虽然已经成为当今的聚焦的热点，但是miRNAs调控在颈动脉狭窄的调控机制如何，是否也如同AS一样，也是通过粥样硬化斑块影响其作用机制，尚未见相关报道。申请者在前期研究中发现miR-143/145基因簇能够决定SMCs向收缩表型转化，从而缓解AS进程，特别是维持斑块稳定性。申请者及项目组成员利用在线预测工具（Targetscan(www.targetscan.org)、miRanda(www.microrna.org)、TarBase(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/tarbase)）对miR-145的靶基因进行了分析，发现其靶基因包括低密度脂蛋白受体（NM_174902）、清道夫受体BI（NM_001082959）、多个肿瘤坏死因子超家族成员、多种激酶、生长因子、转录因子等，这些基因均与AS发生发展密切相关。

六、结语

综上所述，本项目提出以下假设：在颈动脉狭窄的患者，粥样硬化斑块形成之后，炎症、应激、缺氧等使斑块不稳定的因素，可以刺激斑块内的细胞发生死亡、炎症因子分泌增多，进一步引发斑块破裂；颈动脉粥样硬化病变诱导miR-145表达升高，miR-145作为一种基因调控分子，能够抑制相关的靶基因，从而维持颈动脉粥样硬化斑块的稳定性。本项目首先收集正常人、粥样硬化性颈动脉狭窄患者和不稳定性斑块颈动脉狭窄患者外周血，收集分离单核细胞和T淋巴细胞，检测3组患者外周血中miR-145的表达改变，期望寻找粥样硬化性颈动脉狭窄的早期标志物，为动脉粥样硬化性颈动脉瘤的早期防治提供新的思路与实验线索。

【参考文献】

[1]Gu,Yuanyuan;Feng,Laihui;Xu,Yu;etal.Co-prevalenceofcarotidstenosisandcoronaryarterydiseaseinChinesepatientswithparoxysmalatrialfibrillation.JOURNALOFINTERNATIONALMEDICALRESEARCH.2014,6(42):1294-1300.

[2]杨永宗,动脉粥样硬化性心血管病基础与临床,科学出版社,北京,2004.

[3]Linni,K.;Aspalter,M.;Neureiter,D;etal.Postoperativebloodpressureinpatientsundergoingeversioncarotidendarterectomywithorwithoutresectionofthecarotidsinusnerve.EUROPEANSURGERY-ACTACHIRURGICAAUSTRIACA.2014,6(46):244-249.

[4]Evensen,Kristin;Slevolden,etal.Increasedsubclinicalatherosclerosisinpatientswithchronicplaquepsoriasis.ATHEROSCLEROSIS,2(237):499-503