EGCG对THP-1源性泡沫细胞ABCA1的影响及其机制

EGCG对THP-1源性泡沫细胞ABCA1的影响及其机制

杨红霞1蒋恒波2

1湖南省永州职业技术学院湖南永州425000；2湖南省新田县中医医院湖南永州425000

【摘要】目的：探究EGCG对THP-1源性泡沫细胞ABCA1的影响及其机制。方法：本研究于2017年4月～2018年4月在我院实验室展开试验，采用不同浓度的EGCG对泡沫细胞进行处理，然后对其进行收集和实验，采用TNF-α对THP-1源性泡沫细胞进行处理，然后观察EGCG对THP-1源性泡沫细胞ABCA1的影响。结果：EGCG预处理通过抑制NF-B起到衰减TNF-α对ABCA1的抑制作用。EGCG能够激活Nrf2和Keap1起到抑制NF-B的作用。结论：对于THP-1源性泡沫细胞而言，EGCG主要通过Nrf2和Keap1两种途径抑制NF-B激活，然后促使ABCA1上调，进而促进细胞内的胆固醇流出。

【关键词】EGCG；THP-1源性泡沫细胞；ABCA1

EGCG是从绿茶中提取出来的一种物质，由于具有调节脂代谢以及抗炎等作用，其在促进胆固醇逆向运转以及抗动脉粥样硬化方面起到重要的价值[1-2]。通过对已有文献的检索，发现关于EGCG对ABCA1的影响以及相应的机制还不是十分分的明确[3]。因此，本研究采用TNF-α对THP-1源性泡沫细胞进行处理，以观察EGCG对ABCA1的影响及其机制，现报道如下。

1资料与方法

1.1试验材料以及仪器

本研究于2017年4月～2018年4月在我院实验室展开试验。在进行实验的过程中，采用的实验材料主要有THP-1源性泡沫细胞，生产厂家是上海细胞生物所。ABCA1兔抗认、Nrf2兔抗人、Keap1兔抗人，生产厂家是Novus公司。在实验中，使用的仪器主要有CO2培养箱，生产厂家是Shelodon公司。倒置生物显微镜，生产厂家是日本的Olympus公司。高速离心机（型号为5804）、PCR仪器，生产厂家是德国的EP公司。其他试验材料以及仪器主要来自我国。

1.2方法

在进行实验的过程中，试验的方法主要包括以下几点：（1）对细胞进行培养。在进行THP-1细胞培养的过程中，使用培养箱，将温度控制在37℃的温度下进行培养，CO2的含量为5%。在进行实验的过程中，主要选取对数期的细胞，且每次实验前将THP-1细胞孵育，孵育的时间为24h，以诱导其分化成为巨噬细胞。（2）细胞毒性检验。在对细胞的毒性进行检验的过程中，采用的方法是MTT方法。（3）油红O染色处理。首先将THP-1细胞放置在6空培养板内，以促使其形成泡沫细胞。然后对细胞进行洗涤，次数为3次，并使用油红O对其进行染色处理，时间为10min。再次，采用去离子水对其进行冲洗。结束后，封片，使用显微镜进行观察。（4）其他。对THP-1细胞进行荧光素酶测定，然后提取细胞中蛋白。同时，采用PCR对DNA进行录制。然后，使用LABWORK凝胶图像分析系统对扫描胶片。除此之外，还应对THP-1细胞进行胆固醇流出试验等。

1.3观察指标

在进行实验的过程中，主要观察了EGCG对THP-1细胞胆固醇流出、脂质蓄积的影响，EGCG对ABCA1的影响等相关内容。

1.4统计学处理

应用GraphpadV5.0软件对数据进行分析。计量资料采用（）表示，（t）进行校验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1EGCG通过衰减TNF-α对THP-1巨噬细胞内胆固醇流出以及脂质积蓄造成影响

采用佛波酯160nmol诱导THP-1细胞以促使其转化为巨噬细胞。同时，对其进行培养，以促使其形成泡沫细胞。然后，加入不同浓度的EGCG，浓度分别为0μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL，对细胞进行培养。并设不加TNF-α以及加入LXR激动剂T0901317别作为阴性对照组和阳性对照组进行比较。通过胆固醇流出实验，分析EGCG对THP-1细胞胆固醇流出的影响。结果显示，相比于对照组，含有TNF-α组的胆固醇流量显著减少（P＜0.05）。EGCG单独处理与对照组相比不存在统计学差异（P>0.05）。相比于TNF-α处理，浓度为40μg/mL，80μg/mL的EGCG预处理组，胆固醇流出显著增加（P＜0.05）。

通过油红O染色以观察EGCG对细胞脂质蓄积的影响。结果显示，相比于对照组，TNF-α在处理的过程中，其更能够增加脂质蓄积（P＜0.05）。EGCG预处理能够减少脂质蓄积（P＜0.05）。

本研究还采用MTT方法分析了不同浓度的EGCG对细胞毒性的影响，结果显示，不同浓度的EGCG在对细胞进行处理的过程中，其数量变化不存在统计学差异（P>0.05）。同时，采用PCR方法以及荧光素酶等对EGCG以及TNF-α对THP-1细胞内的ABCA1的影响进行了观察。结果显示，EGCG与TNF-α结合预处理能够显著增加ABCA1水平（P＜0.05）。单一的EGCG或单一的TNF-α处理变化差异不大。单一的TNF-α处理能够降低ABCA1水平。

2.2EGCG通过抑制NF-B衰减TNF-α对ABCA1的作用

相比于对照组，单一的EGCG对于胆固醇流出没有变化。单一的T0901317在促进胆固醇流出方面有重要的效果。采用瞬时转染和荧光素酶对细胞进行检验，并对两组的数据进行比较。结果显示，相比于瞬时转染方法中的研究结果，T0901317对这一方法中的启动子质粒没有影响。TNF-α则可以降低ABCA1中的活性。EGCG处理能够增加这种活性。采用EMSA检测方法分析EGCG、TNF-α在THP-1细胞中NF-B活性的影响。结果显示，与对照组相比，EGCG处于在减轻条带灰度方面有重要的效果。

2.3EGCG通过Nrf2和Keap1抑制NF-B进而起到衰减TNF-α对ABCA1的作用

通过检测EGCG、TNF-α对Nrf2的影响，结果显示，相比于对照组，EGCG在增加Nrf2核蛋白方面有显著的效果（P＜0.05）。TNF-α在减少Nrf2核蛋白方面有显著的效果（P＜0.05）。通过分析EGCG、TNF-α对Keap1的影响，结果显示，EGCG能够增加NF-Bp65核蛋白水平。对Keap1进行干扰，部分会对EGCG造成影响。

3讨论

绿茶是我国重要的保健养生饮品之一，其主要的生物活性成分是茶多酚，组成部分主要包括茶素、黄铜素、花色素以及酚酸类物质。EGCG是一种含量最做的茶素，能够起到诸多的药理学作用。有研究学者在研究中认为EGCG具有抗动脉粥样硬化的作用，其作用机制是EGCG与肠道内的胆固醇形成沉淀物，进而起到抑制肠道内酶的作用，以降低胆固醇吸收。同时，EGCG还具有抗低密度脂蛋白氧化的作用，因而能够起到抗疾病的效果[4]。近年来，人们对EGCG在抗这一疾病的作用进行了进一步的深入研究，并认为EGCG能够通过上调ABCA1促进胆固醇流出，这为抑制抗动脉粥样硬化提供了新的机制。然而，关于EGCG在调节ABCA1的机制方面还有待进一步的深入研究。因此，本文从这一角度进行了分析。

通过本文的研究，结果显示，EGCG预处理通过抑制NF-B起到衰减TNF-α对ABCA1的抑制作用。EGCG能够激活Nrf2和Keap1起到抑制NF-B的作用。也就是说，在THP-1细胞中，TNF-α通过降低ABCA1水平以减少胆固醇的流出。EGCG通过抑制NF-B的活化以减轻TNF-α对细胞的毒害。在对NF-B进行抑制的过程中，机制主要是通过Nrf2和Keap1。综上所述，对于THP-1源性泡沫细胞而言，EGCG主要通过Nrf2和Keap1两种途径抑制NF-B激活，然后促使ABCA1上调，进而促进细胞内的胆固醇流出。总之，通过本文的研究能够为动脉粥样硬化提供新思路。

参考文献：

[1]王婷，周红，夏龙飞，等.EGCG干预LPS诱导的THP-1细胞TLR4及下游通路的活化[J].中国新药杂志，2016（13）：1517-1521.

[2]WangT，ZhouH，XiaLF，etal.EffectofEGCGontheexpressionofTLR4anditsdownstreamsignaltransductionpathwayinhumanTHP-1monocytes[J].ChineseJournalofNewDrugs，2016.

[3]杨红霞，高亚，蒋恒波，等.EGCG通过miR-33a上调ABCA1表达减少巨噬细胞脂质蓄积[J].中国药理学通报，2016，32（9）：1279-1284.

[4]ZhouT，DingJW，WangXA，etal.LongnoncodingRNAsandatherosclerosis.[J].Atherosclerosis，2016，248：51-61.

作者简介：杨红霞（1980--），女，硕士，副教授，研究方向：心血管药理，

蒋恒波（1976--），男，本科，副主任医师，研究方向：心血管内科，

基金项目：2107年湖南省教育厅优秀青年项目科研课题，项目编号：17B274。