1湖南省永州职业技术学院湖南永州425000;2湖南省新田县中医医院湖南永州425000
【摘要】目的:探究EGCG对THP-1源性泡沫细胞ABCA1的影响及其机制。方法:本研究于2017年4月~2018年4月在我院实验室展开试验,采用不同浓度的EGCG对泡沫细胞进行处理,然后对其进行收集和实验,采用TNF-α对THP-1源性泡沫细胞进行处理,然后观察EGCG对THP-1源性泡沫细胞ABCA1的影响。结果:EGCG预处理通过抑制NF-B起到衰减TNF-α对ABCA1的抑制作用。EGCG能够激活Nrf2和Keap1起到抑制NF-B的作用。结论:对于THP-1源性泡沫细胞而言,EGCG主要通过Nrf2和Keap1两种途径抑制NF-B激活,然后促使ABCA1上调,进而促进细胞内的胆固醇流出。
【关键词】EGCG;THP-1源性泡沫细胞;ABCA1
EGCG是从绿茶中提取出来的一种物质,由于具有调节脂代谢以及抗炎等作用,其在促进胆固醇逆向运转以及抗动脉粥样硬化方面起到重要的价值[1-2]。通过对已有文献的检索,发现关于EGCG对ABCA1的影响以及相应的机制还不是十分分的明确[3]。因此,本研究采用TNF-α对THP-1源性泡沫细胞进行处理,以观察EGCG对ABCA1的影响及其机制,现报道如下。
1资料与方法
1.1试验材料以及仪器
本研究于2017年4月~2018年4月在我院实验室展开试验。在进行实验的过程中,采用的实验材料主要有THP-1源性泡沫细胞,生产厂家是上海细胞生物所。ABCA1兔抗认、Nrf2兔抗人、Keap1兔抗人,生产厂家是Novus公司。在实验中,使用的仪器主要有CO2培养箱,生产厂家是Shelodon公司。倒置生物显微镜,生产厂家是日本的Olympus公司。高速离心机(型号为5804)、PCR仪器,生产厂家是德国的EP公司。其他试验材料以及仪器主要来自我国。
1.2方法
在进行实验的过程中,试验的方法主要包括以下几点:(1)对细胞进行培养。在进行THP-1细胞培养的过程中,使用培养箱,将温度控制在37℃的温度下进行培养,CO2的含量为5%。在进行实验的过程中,主要选取对数期的细胞,且每次实验前将THP-1细胞孵育,孵育的时间为24h,以诱导其分化成为巨噬细胞。(2)细胞毒性检验。在对细胞的毒性进行检验的过程中,采用的方法是MTT方法。(3)油红O染色处理。首先将THP-1细胞放置在6空培养板内,以促使其形成泡沫细胞。然后对细胞进行洗涤,次数为3次,并使用油红O对其进行染色处理,时间为10min。再次,采用去离子水对其进行冲洗。结束后,封片,使用显微镜进行观察。(4)其他。对THP-1细胞进行荧光素酶测定,然后提取细胞中蛋白。同时,采用PCR对DNA进行录制。然后,使用LABWORK凝胶图像分析系统对扫描胶片。除此之外,还应对THP-1细胞进行胆固醇流出试验等。
1.3观察指标
在进行实验的过程中,主要观察了EGCG对THP-1细胞胆固醇流出、脂质蓄积的影响,EGCG对ABCA1的影响等相关内容。
1.4统计学处理
应用GraphpadV5.0软件对数据进行分析。计量资料采用()表示,(t)进行校验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1EGCG通过衰减TNF-α对THP-1巨噬细胞内胆固醇流出以及脂质积蓄造成影响
采用佛波酯160nmol诱导THP-1细胞以促使其转化为巨噬细胞。同时,对其进行培养,以促使其形成泡沫细胞。然后,加入不同浓度的EGCG,浓度分别为0μg/mL,20μg/mL,40μg/mL,80μg/mL,对细胞进行培养。并设不加TNF-α以及加入LXR激动剂T0901317别作为阴性对照组和阳性对照组进行比较。通过胆固醇流出实验,分析EGCG对THP-1细胞胆固醇流出的影响。结果显示,相比于对照组,含有TNF-α组的胆固醇流量显著减少(P<0.05)。EGCG单独处理与对照组相比不存在统计学差异(P>0.05)。相比于TNF-α处理,浓度为40μg/mL,80μg/mL的EGCG预处理组,胆固醇流出显著增加(P<0.05)。
通过油红O染色以观察EGCG对细胞脂质蓄积的影响。结果显示,相比于对照组,TNF-α在处理的过程中,其更能够增加脂质蓄积(P<0.05)。EGCG预处理能够减少脂质蓄积(P<0.05)。
本研究还采用MTT方法分析了不同浓度的EGCG对细胞毒性的影响,结果显示,不同浓度的EGCG在对细胞进行处理的过程中,其数量变化不存在统计学差异(P>0.05)。同时,采用PCR方法以及荧光素酶等对EGCG以及TNF-α对THP-1细胞内的ABCA1的影响进行了观察。结果显示,EGCG与TNF-α结合预处理能够显著增加ABCA1水平(P<0.05)。单一的EGCG或单一的TNF-α处理变化差异不大。单一的TNF-α处理能够降低ABCA1水平。
2.2EGCG通过抑制NF-B衰减TNF-α对ABCA1的作用
相比于对照组,单一的EGCG对于胆固醇流出没有变化。单一的T0901317在促进胆固醇流出方面有重要的效果。采用瞬时转染和荧光素酶对细胞进行检验,并对两组的数据进行比较。结果显示,相比于瞬时转染方法中的研究结果,T0901317对这一方法中的启动子质粒没有影响。TNF-α则可以降低ABCA1中的活性。EGCG处理能够增加这种活性。采用EMSA检测方法分析EGCG、TNF-α在THP-1细胞中NF-B活性的影响。结果显示,与对照组相比,EGCG处于在减轻条带灰度方面有重要的效果。
2.3EGCG通过Nrf2和Keap1抑制NF-B进而起到衰减TNF-α对ABCA1的作用
通过检测EGCG、TNF-α对Nrf2的影响,结果显示,相比于对照组,EGCG在增加Nrf2核蛋白方面有显著的效果(P<0.05)。TNF-α在减少Nrf2核蛋白方面有显著的效果(P<0.05)。通过分析EGCG、TNF-α对Keap1的影响,结果显示,EGCG能够增加NF-Bp65核蛋白水平。对Keap1进行干扰,部分会对EGCG造成影响。
3讨论
绿茶是我国重要的保健养生饮品之一,其主要的生物活性成分是茶多酚,组成部分主要包括茶素、黄铜素、花色素以及酚酸类物质。EGCG是一种含量最做的茶素,能够起到诸多的药理学作用。有研究学者在研究中认为EGCG具有抗动脉粥样硬化的作用,其作用机制是EGCG与肠道内的胆固醇形成沉淀物,进而起到抑制肠道内酶的作用,以降低胆固醇吸收。同时,EGCG还具有抗低密度脂蛋白氧化的作用,因而能够起到抗疾病的效果[4]。近年来,人们对EGCG在抗这一疾病的作用进行了进一步的深入研究,并认为EGCG能够通过上调ABCA1促进胆固醇流出,这为抑制抗动脉粥样硬化提供了新的机制。然而,关于EGCG在调节ABCA1的机制方面还有待进一步的深入研究。因此,本文从这一角度进行了分析。
通过本文的研究,结果显示,EGCG预处理通过抑制NF-B起到衰减TNF-α对ABCA1的抑制作用。EGCG能够激活Nrf2和Keap1起到抑制NF-B的作用。也就是说,在THP-1细胞中,TNF-α通过降低ABCA1水平以减少胆固醇的流出。EGCG通过抑制NF-B的活化以减轻TNF-α对细胞的毒害。在对NF-B进行抑制的过程中,机制主要是通过Nrf2和Keap1。综上所述,对于THP-1源性泡沫细胞而言,EGCG主要通过Nrf2和Keap1两种途径抑制NF-B激活,然后促使ABCA1上调,进而促进细胞内的胆固醇流出。总之,通过本文的研究能够为动脉粥样硬化提供新思路。
参考文献:
[1]王婷,周红,夏龙飞,等.EGCG干预LPS诱导的THP-1细胞TLR4及下游通路的活化[J].中国新药杂志,2016(13):1517-1521.
[2]WangT,ZhouH,XiaLF,etal.EffectofEGCGontheexpressionofTLR4anditsdownstreamsignaltransductionpathwayinhumanTHP-1monocytes[J].ChineseJournalofNewDrugs,2016.
[3]杨红霞,高亚,蒋恒波,等.EGCG通过miR-33a上调ABCA1表达减少巨噬细胞脂质蓄积[J].中国药理学通报,2016,32(9):1279-1284.
[4]ZhouT,DingJW,WangXA,etal.LongnoncodingRNAsandatherosclerosis.[J].Atherosclerosis,2016,248:51-61.
作者简介:杨红霞(1980--),女,硕士,副教授,研究方向:心血管药理,
蒋恒波(1976--),男,本科,副主任医师,研究方向:心血管内科,
基金项目:2107年湖南省教育厅优秀青年项目科研课题,项目编号:17B274。