精胺对 Ox-LDL介导的内皮细胞损伤的作用及机制研究

精胺对 Ox-LDL介导的内皮细胞损伤的作用及机制研究

杨金霞 1*,汪雨 2, 李倩 1,王琳 3,梁春红 1

（¹大庆医学高等专科学校病理与病理生理学教研室,²大庆油田总医院B超室, ³大庆医学高等专科学校生理学教研室,黑龙江 大庆 163312）

[摘要] 目的：建立Ox-LDL诱导内皮细胞损伤模型，观察外源性精胺对细胞凋亡及信号通路的影响，探讨精胺减轻细胞损伤的可能机制。

方法：建立Ox-LDL损伤细胞模型后，给予外源性精胺后检测各组细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达情况。

结果：Ox-LDL组内皮细胞总凋亡率明显高于Control组和Sp组，Ox-LDL上调了磷酸化p38活性，差异具有统计学意义（P < 0.05）；精胺预处理后，内皮细胞凋亡率较Ox-LDL组明显减少，降低了磷酸化p38的活性，差异具有统计学意义（Ｐ＜0.05）。

结论：外源性精胺可减轻Ox-LDL诱导内皮细胞损伤及凋亡，其机制可能通过抑制线粒体凋亡信号通路，发挥对内皮细胞的保护作用。

[关键词] 精胺；Ox-LDL；细胞凋亡

动脉粥样硬化（atherosclerosis ，AS）是心脑血管病的主要病因，严重危害人类健康。氧化应激与动脉粥样硬化的发生发展密切相关^[1]。具有细胞毒性作用的氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL），被认为是导致AS发生发展的独立危险因素，能诱导血管内皮细胞凋亡，进而启动AS的发生^[2]。精胺(Spermine,Sp) 是带有四价阳离子的生物胺，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗凋亡等作用^[3]。

本研究通过建立Ox-LDL损伤细胞模型后，给予外源性精胺后检测各组细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达情况，探讨精胺减轻细胞损伤的可能机制。

材料和方法

1 材料及仪器

1.1 实验对象 人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)，购自于北医肿瘤研究所。

1.2 主要试剂及仪器 精胺（sigma），Ox-LDL（北京协生生物科技有限责任公司），胰酶，DMEM培养基，胎牛血清，Hoechst 33342染色试剂盒，Annexin Ⅴ-FITC/PI染色试剂盒，P38抗体，倒置显微镜(日本OLYMPUS)，CO₂培养箱(日本SANYO) ，BIO-RAD 550酶标仪（美国伯乐公司）等。

2 HUVEC的复苏与传代培养

内皮细胞株复苏后，用含10%胎牛血清DMEM培养液接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中静置培养，待内皮细胞贴壁长满培养瓶底部后，进行细胞传代。取3-5代生长良好的细胞用于实验。

3 实验分组

① Control组；②Sp组； ③Ox-LDL组；④Sp+Ox-LDL；⑤Ox-LDL+SB203580；⑥Sp+Ox-LDL+SB203580组，均培养24 h。

4 观察指标

采用CCK-8测定细胞活力；Hoechst 33342染色和Annexin Ⅴ-FITC/PI染色检测细胞凋亡，蛋白免疫印迹技术检测P38蛋白表达。

5 统计学处理

所有计量数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，P <0.05表示差异显著。

结 果

1 HUVEC活力测定

与Control比较，Ox-LDL组细胞活力降低(P <0.05)；加入Sp后，增加细胞活力，与Ox-LDL组比较差异显著(P <0.05)。

图-1.不同浓度的Ox-LDL和精胺对内皮细胞活力的影响。

^*P <0.05，与Control组比较. ^#P <0.05，与Ox-LDL组比较

2 Hoechst 33342染色

Control组和Sp组中，细胞核呈低蓝色占绝大多数，说明无明显细胞凋亡；Ox-LDL组中，细胞核呈高蓝色明显增多，细胞核呈现高亮、固缩和碎裂，提示凋亡细胞数目明显增加；Sp+Ox-LDL组中凋亡细胞数较Ox-LDL组明显减少(P < 0.05)

图-2.Hoechst33342染色检测细胞凋亡。

3 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色

Ox-LDL组内皮细胞总凋亡率明显高于Control组和Sp组，差异具有统计学意义（P < 0.05）；精胺预处理后，内皮细胞凋亡率较Ox-LDL组明显减少，差异具有统计学意义（P < 0.05）。

4 磷酸化p38蛋白表达

Ox-LDL上调了磷酸化p38活性，与正常对照组比较，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与Ox-LDL组相比，精胺降低了磷酸化p38的活性，差异具有统计学意义（P < 0.05）。

讨论

AS是一种缓慢进展的疾病，其发生发展是一个复杂的过程，其发病机制尚未完全清楚。与AS发病机制相关的学说主要有脂质浸润学说、内皮损伤学说、炎症学说、氧化应激反应学说和感染学说等。目前，仍没有完全阐明动脉粥样硬化的发生机制，因而对动脉粥样硬化的防治缺乏有效的措施。

通过检测细胞活力，确定了本实验所用的Ox-LDL浓度和精胺浓度；为了观察精胺对细胞损伤的影响，我们采用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色和Hoechst 33342染色检测细胞凋亡，结果显示精胺减轻Ox-LDL诱导的细胞凋亡；为进一步探讨精胺减轻细胞凋亡的机制，我们测定了凋亡相关蛋白P38的表达情况，结果显示精胺降低了磷酸化p38的活性。有文献报道，精胺可抑制线粒体通透性转换孔开放，在小鼠WEH1231B细胞和人的T细胞，多胺合成抑制剂引起线粒体膜电位下降和Caspase-3激活，外源性多胺可逆转上述改变。我们的实验结果与文献报道相一致。本研究结果表明，外源性精胺可能通过抑制线粒体P38凋亡信号通路，减少Ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡，发挥对内皮细胞的保护作用。我们还将继续在分子水平研究精胺抗氧化的可能机制，为精胺防治动脉粥样硬化提供理论依据。

1. 黄卫江, 陈朝俊, 付强. 参七脉心通胶囊对动脉粥样硬化斑块稳定影响的实验

研究. 中西医结合心脑血管病杂志.2009;7(11):1310-1311.

2. Puca AA, Carrizzo A, Villa F, Ferrario A, Casaburo M, Maciąg A, Vecchione C.

Vascular ageing: the role of oxidative stress. Int J Biochem Cell Biol. 2013;

45(3):556-559.

3. Khuhawar MY, Qureshi GA. Polyamines as cancer markers: applicable separation

methods. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2001;(764):385-407.