妍婷灌肠液对炎性不孕大鼠输卵管肿瘤坏死因子α及细胞间黏附分子-1的影响

【摘要】 目的探讨中药复方妍婷灌肠液（妍婷）治疗输卵管炎性不孕的疗效与机制。方法以混合菌接种法制作Wistar雌性大鼠输卵管炎性不孕模型，分为正常对照组、模型对照组、妍婷灌胃组以及妍婷灌肠组。分别于术后20 d开始服药,至妍婷干预后15，30 d各取8只以观察疗效。用免疫组织化学方法检测大鼠输卵管组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）蛋白表达，并于疗程结束后每组各取8只，观察各组受孕情况。结果治疗组大鼠于妍婷干预15，30d后, 输卵管组织中TNF-α及ICAM-1蛋白表达高于正常对照组，妍婷灌胃组低于模型组，妍婷灌肠组低于模型组和妍婷灌胃组。结论中药妍婷可以降低输卵管炎性大鼠组织中TNF-α及ICAM-1蛋白表达，疏解粘连，促进输卵管再通，提高受孕率，从而对大鼠输卵管炎性不孕具有很好的治疗作用。

【关键词】 中药复方/妍婷 输卵管炎性不孕 肿瘤坏死因子-α 细胞间黏附分子-1 免疫组化

盆腔感染后导致输卵管阻塞或和输卵管、卵巢有关的盆腔粘连是不孕的主要原因之一。既往文献报道多从临床观察角度研究疗效，很少从分子水平阐明治疗机制。中医中药治疗输卵管炎性阻塞性不孕具有低毒高效、价格低廉的特点，易为广大患者接受。本实验从分子水平研究妍婷灌肠液（以下称妍婷）治疗输卵管炎症的机制。现报道如下。

1 材料

实验于2005-03～2005-07在黑龙江中医药大学国家三级实验室中医妇科药理实验室进行。8～12周清洁级Wistar雌性大鼠，体质量（200±20）g。溶血性链球菌（菌号：ATCC32133），金黄色葡萄球菌（菌号：ATCC25923），大肠杆菌（菌号：ATCC25922）。以大肠杆菌、金葡菌、链球菌按2∶1∶1比例用无菌生理盐水稀释，配成浓度约为30亿个/ml的混合菌。妍婷灌肠液为临床经验方,由哈尔滨世一堂药厂按原方制备成颗粒剂,主要由赤芍、延胡索、丹参、三棱、莪术、红藤、皂刺、败酱草、川楝子等组成。按人鼠体质量比换算后,以2.7 g/kg用生理盐水溶解后给药。

2 方法

采用混合菌接种法［1］建模：用20%乌拉坦（剂量按5 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠,分别在子宫角近输卵管处进针，向输卵管-卵巢方向注射细菌悬液各0.1 ml。手术时尽量避免损伤其他组织。分层关腹,消毒手术区,铺无菌垫料。恢复饮水,正常清洁饲养。建模后经筛选,将109只大鼠按随机表法分为4组:正常对照组30只(同条件下饲养的正常鼠)、模型组27只［造模后20 d开始给生理盐水, 20 ml/（kg·d）］、妍婷灌胃组26只以及妍婷灌肠组26只。

2.1 观察指标

2.1.1 肉眼观察观察输卵管形状、色泽改变情况, 与周围组织有无黏连, 是否增粗或变细, 弹性有无变化，以及有无积水、化脓等。

2.1.2 病理改变光镜下观察输卵管组织细胞结构变化。

2.1.3 用免疫组织化学方法检测输卵管组织TNF-α及ICAM- 1 蛋白表达:用药 15 d 及 30 d 后, 随机对每组大鼠各取 8只保存备测。石蜡标本切成 4 μm 厚的切片, 详细步骤按照说明书进行。结果判断: 镜下观察细胞以胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒或斑片为阳性反应。

2.1.4 妍婷干预对大鼠受孕率的影响于疗程结束后每组各取8只，雌雄合笼，连续观察30 d，计算各组受孕情况。

2.2 统计学分析计算机图像分析, 在图像卡( 北京天地公司设计)IBM586 和 OlympusBX60 显微镜组成的图像处理系统上, 测定阳性细胞数：每组每只大鼠输卵管各 5 个高倍 (400×) 视野下测阳性细胞密度( 个/mm2)。受孕率组间比较用t检验。

3 结果

3.1 肉眼观察 与正常对照组相比, 肉眼观察造模后输卵管明显变粗糙, 与周围组织或多或少有黏连, 色泽苍白,脆而易于破损, 部分输卵管及其周围可见积水或积脓。

3.2 病理观察 正常对照组大鼠输卵管管壁组织结构清晰,管腔通畅, 纵、环肌层界限清, 上皮细胞表面有较多微绒毛, 细胞间紧密连接, 间质细胞排列紧密。模型组造模后20 d管壁组织结构分界不清晰, 纤维组织明显增生, 管腔内纤毛凌乱, 黏连、增粗、变短或消失, 管腔部分阻塞, 环肌层、黏膜层水肿, 肌层可见大量炎细胞浸润, 胶原纤维明显增多。证明造模成功。

3.3 妍婷干预对大鼠肿瘤坏死因子α蛋白表达的影响正常对照组无肿瘤坏死因子α表达。各组大鼠肿瘤坏死因子α蛋白表达见表1。模型组造模后肿瘤坏死因子α表达量高于正常对照组，差异显著（P<0.01）；妍婷灌肠组与灌胃组治疗后TNF-α表达量明显低于模型组，差异显著（P<0.01）； 妍婷灌肠组TNF-α表达量低于灌胃组及模型组，差异显著（P<0.01）。治疗15 d肿瘤坏死因子α表达量与30 d相比，差异不显著（P＞0.05）。见表1。

3.4 妍婷干预对大鼠ICAM- 1蛋白表达的影响正常对照组未见有ICAM- 1蛋白表达。模型组 15，30 d, ICAM- 1 蛋白表达较多, 高于正常对照组(P<0.05)。给药 15，30 d, 中药灌胃组表达较少,低于模型组(P<0.05); 中药灌肠组明显低于模型组(P<0.01), 亦低于中药灌胃组(P<0.05)，30 d 已偶见表达。见表2。表1 实验各组输卵管TNF-α蛋白表达阳性细胞数表2 实验各组输卵管ICAM- 1蛋白表达阳性细胞数

3.5 妍婷干预对炎性不孕大鼠受孕情况的影响结果显示，模型组受孕率明显低于正常组、灌胃组和灌肠组。详见表3。表3 各组大鼠受孕情况4 讨论

输卵管性不孕致病菌主要有细菌、病毒、原虫、支原体，其中以细菌感染最多。西医治疗主要为抗生素治疗配合外治法，疗效不理想。近年来腔镜技术及辅助生育技术被应用于临床，短期疗效确切［2］，但其费用昂贵，且容易复发，在我国很难普遍应用。中医治疗输卵管炎性不孕症方法颇多，以中药内外合用效果较好［3］。侯丽辉教授认为输卵管炎性不孕核心病机在于血淤胞宫，脉络不通。治疗应活血化瘀，通经活络，基于此法创立了妍婷，在临床上治疗输卵管炎性不孕取得了显著疗效。妍婷主要由赤芍、元胡、丹参、三棱、莪术、红藤、败酱草、皂刺、川楝子等9味药组成。诸药合用，共同达到活血化瘀、通经活络的作用。现代药理研究证实［4］，应用活血化瘀中药能改善盆腔局部的微循环和组织营养，吸收炎症病灶，有利于输卵管粘连的松解，减少再闭塞率，抑制纤维组织的增生的功能。同时也进行了妍婷的抑菌实验，结果为对大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌抑菌效价为 1∶128；对柠檬色葡萄球菌、表皮葡萄球菌抑菌效价为 1∶32。证明妍婷对输卵管炎主要致病菌有抑制作用。

近年来一些学者越来越关注输卵管炎性不孕与炎性介质有密切关系。有人总结出TNF-α在妇女不孕症发生发展中的作用［5］：抑制精子活力，使精子受精能力减弱、影响卵泡发育、干扰精卵结合、影响黄体功能导致黄体功能失调、抑制输卵管对卵子的捕获及孕卵的输送、早期的胚胎毒作用、发生炎症反应、造成盆腔粘连、机械性干扰生殖过程。

本实验采用具有免疫调节活性及有炎症介导活性的TNF-a作为检测指标，发现在输卵管炎性不孕模型大鼠的输卵管局部组织及血清TNF-α中含量显著增高，提示TNF-a在输卵管炎慢性反应阶段是一个重要的介质，在一定程度上反映了TNF-α与慢性输卵管炎的病变程度及其继发不孕有关。进一步研究发现应用妍婷灌肠剂治疗后TNF-α水平明显下调，表明妍婷灌肠剂可能通过此途径而治疗输卵管炎性阻塞性不孕。实验中妍婷干预15 d与30 d组输卵管组织中蛋白含量间无统计学差异，提示如果进行免疫治疗可能在炎症的初期效果较好，且可能无需长期应用。

ICAM- 1 属免疫球蛋白家族之成员, 又名 CD54,是一种重要的细胞表面黏附因子, 分布广泛, 可出现在活化的淋巴细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、各种上皮细胞及成纤维细胞表面, 并具有介导白细胞向炎症移动及与血管内皮细胞黏附的“滚动”受体功能。通过白细胞激活, 释放大量炎症介质, 调控网络的平衡功能丧失, 进一步引起微血管阻塞, 阻断血流致局部缺血［6］。

本实验中模型组 ICAM- 1 蛋白表达较高, 且治疗 15，30 d 均有较高表达。关于黏附分子的作用机制可能是黏附分子促进白细胞浸润至炎症部位, 白细胞与内皮细胞牢固黏附后, 内皮细胞表型和功能激活, 其表达某些黏附分子和细胞因子增加, 进而增加血管通透性, 促进白细胞浸润至炎症部位, 使炎症加重。经妍婷颗粒治疗后 ICAM- 1 蛋白表达降低, 且差异显著。表明妍婷颗粒能够抑制 ICAM-1 蛋白表达，发挥其抗炎症作用。

从大鼠受孕情况的观察可见，妍婷灌胃组及灌肠组都使大鼠受孕情况得到明显改善，以灌肠组更明显，与模型组比较，差异显著。本实验说明，妍婷可以明显减轻输卵管炎性大鼠输卵管组织局部充血水肿，松解组织粘连，抑制纤维组织的生成和发展,使输卵管复通，并能促进管腔黏膜内皮的修复与再生，改善输卵管内的受精环境，提高输卵管运送卵子及受精卵的功能。在临床中如果能灌肠与灌胃合用，使其优势互补,将进一步提高输卵管炎性不孕的临床疗效。

【参考文献】
［1］ 赵广兴，王春田，马宝璋，等.大鼠输卵管炎性不孕模型的建立［J］.中国比较医学杂志，2004，14（1）：24.

［2］ Lavy Y，Lev-Sagie A, Holtzer H, et al.Should laparoscopy be a mandatory component of the infertility evaluation in infertile women with normal hyste rosalpingogram or suspected unilateral distal tubal pathology［J］. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2004，114( 1):64.

［3］ 孙惠霞.清热活血散结方内服灌肠治疗输卵管阻塞性不孕症78例［J］.陕西中医，2007，28（3）：278.

［4］ Hsu YC，Lin YL, Chiu YT, et al. Antifibrotic effects of Salvia miltiorrhiza on dimethylnitmsamine-intoxicated rats［J］. J Biomed Sci，2005，12: 185.

［5］ 何丽君，姚广涛.肿瘤坏死因子(TNF)在疾病中的双重作用［J］.中国医学理论与实践，2004,14 (7):1013.

［6］ 王 翀，朱贤立，赵洪祥，等.弥漫性脑损伤大鼠脑组织细胞间粘附分子-1的表达与神经元损伤［J］.中国行为医学科学，2006，15(1)：14.