柴胡皂苷d对酒精性肝纤维化大鼠星形细胞活化的影响

(整期优先)网络出版时间:2019-03-18
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作者:李素婷,杨鹤梅,齐洁敏,梅立新

【摘要】   目的研究柴胡皂苷d(SSd)对酒精性肝纤维化大鼠星形细胞(HSC)活化的影响,以探讨SSd抗肝纤维化的作用机制。方法SD大鼠随机分为3组:酒精组、SS-d保护组、正常对照组。利用白酒灌胃辅以高脂饲料方法建立大鼠肝纤维化模型,同时给予SSd保护,12周末处死大鼠。免疫组化检测肝组织α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的表达,H.E染色和VanGieson染色观察肝组织病理改变和纤维组织增生,常规生化方法检测肝功能。结果和模型组比较,SSd明显减少肝组织中αSMA的表达;降低血清ALT,AST活性和肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量;肝组织病理改变明显好转,纤维组织增生明显减少。结论SSd通过降低αSAM表达,抑制肝HSC的活化达到抗肝纤维化作用。

【关键词】 柴胡皂苷 d 肝纤维化 肝星形细胞 α 平滑肌肌动蛋白

  Abstract:ObjectiveTo study the effects of saikosaponin-d (SSd) on the activation of Hepatic Stellate Cells(HSC) and to investigate the main mechanism of SS-d in protection of liver fibrosis.MethodsSD rats were randomly pided into 3 groups:normal group,ethanol-fed group, SSd interventional group.56% distilled alcohol and high fat diet were given orally to the rats of the ethanol-fed group and the SS-d group every day,the rats of SSd group were injected intraperitoneally SSd 2.0 mg·kg-1 once daily.Rats were sacrificed 12 weeks later. The expression of αsmooth muscle actin (αSMA) was detected by immunohistochemistry method. Pathological change in liver tissue was observed under light microscope by H.E and Van-Gieson staining; the content of liver tissue hydroxyproline(Hyp) and liver histopathology were also examined by kivchemistry.ResultsCompared with model group,SSd could reduce the expression of αSMA markedly , improve the pathological changes of liver tissue and decrease the production of fibers significantly,decrease the levels of serum alanine transaminase (ALT),aspartate transaminase(AST) and the contents of liver Hyp significantly .ConclusionSSd can inhibit hepatic fibrosis through inhibiting the expression of αSMA in HSC.

  Key words:SSd; Liver Fibrosis; Hepatic stellate cell; αSMA

  长期过量饮酒可引起酒精性肝病,包括肝脂肪变及炎症损伤,严重者可发展为肝纤维化,甚至导致难以逆转的肝硬化。酒精性肝纤维化是酒精性肝病发展到肝硬化的重要阶段,是一可逆过程,如能去除不利因素,消除肝纤维化将成功阻断肝硬化的发生[1,2]。研究表明,肝星形细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝纤维化时肝脏细胞中胶原的主要来源细胞,HSC活化是肝纤维化形成的中心环节[3,4],本实验用白酒灌胃制备大鼠酒精性肝纤维化模型,观察柴胡皂苷d(SSd)对HSC活化的影响,以探讨中药单体SSd对酒精性肝纤维化预防作用及其机制。

  1 材料与仪器

  1.1 动物

  SpragueDawley大鼠,雄性,清洁级,体重(200±21)g,北京实验动物管理中心提供。

  1.2 试剂

  SSd(纯度为98%):昆明长春花科技有限公司提供,临用前以蒸馏水配置;56度红星二锅头白酒,北京红星酿酒厂生产;ALT,AST,羟脯氨酸(Hyp)检测试剂盒,北京中生生物工程公司;αSMA单抗:购于武汉博士德工程有限公司。

  1.3 仪器

  半自动生化分析仪(MD100),美国Bayer公司生产;721W微机型分光光度计,上海光学仪器五厂产品;Olympus光学显微镜和摄像显微镜,德国Leica公司产品。

  2 方法

  2.1 动物分组及模型的建立

  参考文献[5]略有改动, 取SD大鼠40只,随机分为3组。①酒精组(16只),56度红星二锅头白酒用蒸馏水配制成含40%酒精的白酒,按10 ml·kg-1每日分两次灌胃造模4周,第5周酒精浓度升至50%,继续每日分2次灌胃8周,并辅以高脂饲料(由颗粒料、胆固醇和猪油按79∶1∶20的比例微波炉加热制成);②SSd组(14只),除每天灌胃白酒和高脂饲料外(方法同酒精组),每天上午11点腹腔注射SSd 2 mg·kg-1;③正常对照组(10只),普通饲料通常方法喂养,并以等量的生理盐水作相应处理。各组于造模起第12周末处死大鼠,采集血清及肝组织标本待测相关指标。

  2.2 指标检测

  应用半自动生化分析仪按赖氏法测定血清ALT,AST活性;消化法测定Hyp含量。

  2.3 肝组织形态学观察

  H.E染色光镜下观察肝组织病理改变。V-G胶原纤维特殊染色,进行肝纤维化病理学分级。

  2.4 肝组织αSMA免疫组化法染色

  采用SABC法检测αSMA在大鼠肝组织中的表达。全自动图象分析系统上采用HIPAS2000型图象分析软件进行定量分析,每张切片随机选取10个视野显微摄影系统放大400倍,测定阳性物质所占面积及平均光度,两者乘积越大表明组织中该抗原含量越高。2.5 统计学处理

   数据以±s表示,用SPSS计算机软件进行统计学分析,组间比较采用t检验。

  3 结果

  3.1 肝功能及Hyp含量的测定如表1所示,酒精组血清ALT,AST活性明显升高,肝组织Hyp含量亦明显升高;给予SSd保护后,血清ALT,AST活性和肝组织Hyp含量明显降低(P<0.01);表明SSd有保护肝细胞,拮抗肝纤维化形成的作用。表1 SSd对血清ALT,AST活性和肝脏Hyp含量的影响(略)

  3.2 肝纤维化病理学观察H.E染色:正常组肝组织结构正常,肝细胞排列整齐,肝小叶结构完整,无肝细胞脂肪变性坏死;酒精组大鼠肝组织病理损伤严重,肝小叶结构紊乱,肝细胞呈气球样变及脂肪变性,肝细胞肿胀,胞质疏松,可见较大脂滴;汇管区有炎症细胞浸润,胶原纤维沿汇管区及中央静脉周围向肝小叶内延伸,肝小叶失去正常的结构特点;SS-d保护组上述症状明显减轻,肝细胞有轻度空泡样变性,纤维组织增生明显减少。V-G染色:正常组无明显胶原纤维,酒精组有大量胶原纤维伸入肝小叶,有部分假小叶形成,SS-d组胶原纤维明显减少,纤维隔较薄,无假小叶形成。肝纤维化积分:与酒精组相比,SS-d保护组病理学分期有明显改善(P<0.01)。见表2。表2 SS-d对大鼠肝纤维化积分及α-SMA表达量化结果的影响(略)

  3.3 肝组织α-SMA的表达及量化结果肝组织切片免疫组化染色显示:正常组肝组织α-SMA主要表达于汇管区动、静脉壁,而酒精组α-SMA在汇管区、纤维间隔和肝血窦处均呈阳性表达;SS-d保护组α-SMA表达较模型组有明显减弱,仅在汇管区和纤维间隔内有少量阳性细胞。图象结果分析有显著差异(P<0.01)。见表2。

  4 讨论

  酒精性肝纤维化的病理特征是以胶原蛋白为主的细胞外基质在肝脏的过度增生和广泛沉积。活化的HSC是细胞外基质成分主要的细胞来源,是各种因素所致肝纤维化发生的重要环节[5]。HSC是位于肝窦间隙内的一种特殊状态的成纤维细胞,正常情况下,细胞内存在脂滴,其代谢和功能不活跃,合成胶原功能表达受抑制。在酒精性肝纤维化发展过程中,乙醇及其代谢产物乙醛损伤肝细胞产生大量氧自由基,自由基通过旁分泌和自分泌激活HSC,也可通过细胞因子等多种因素刺激HSC活化。HSC的激活常伴有NF-κB等转录因子的激活及c-myb基因表达的增强,而c-myb蛋白可结合α-SMA基因调控区,提高α-SMA的表达[6~8]。所以α-SMA作为HSC活化的主要标志,与HSC活化的程度及数量呈正相关[9]。活化的HSC不但数量增加,并且向成纤维细胞转化 ,合成大量以胶原蛋白、层粘蛋白为主的细胞外基质,广泛沉积在汇管区和肝小叶内,最终导致肝纤维化。因此,合理抑制HSC活化可逆转肝纤维化的发展,达到在抗肝纤维化目的。

  本研究结果显示,酒精性肝损伤后,肝细胞坏死、炎症细胞浸润,血清ALT,AST活性和肝组织Hyp含量明显升高;免疫组化显示α-SMA在汇管区、纤维间隔和肝血窦处均呈阳性表达; V-G染色显示肝内纤维组织大量增生。表明肝细胞坏死及纤维组织增生与HSC活化有关。而给予SS-d保护后,肝功能及病理改变明显好转,肝组织内α-SMA表达明显减少,仅在汇管区和纤维间隔内有少量阳性细胞,纤维组织增生明显减轻,肝小叶基本正常。表明SS-d对酒精性纤维化具有明显的拮抗作用,而降低α-SMA表达,抑制HSC活化和增殖,减少肝内纤维组织增生可能是其主要机制之一。

参考文献
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