简介：摘要：本文中球状和线状纳米金由柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备得到，并通过透射式电子显微镜（TEM）对球状、线状两种形貌纳米金形貌进行表征。将不同纳米金通过电沉积法分别修饰在碳纤维超微电极表面，采用差分脉冲伏安法（DPV）和循环伏安法（CV）分别对多巴胺（DA，1×10-5 mol/L）在两种形貌纳米金修饰后的碳纤维超微电极上的电化学响应进行对比研究。结果表明使用球状纳米金修饰碳纤维电极检测多巴胺的氧化峰电流稳定性最佳、修饰碳纤维电极测定多巴胺氧化峰电流增幅最明显。

简介：摘要目的探究铁钯纳米颗粒修饰的碳纳米管(FePd@CNTs)对人乳腺癌MCF-7细胞的放射增敏作用。方法用化学还原法制备FePd@CNTs，并通过透射电子显微镜、能谱仪进行表征。CCK-8法检测FePd@CNTs对人正常乳腺上皮MCF-10A细胞的相容性。CCK-8法、流式细胞术和克隆形成实验评估FePd@CNTs对人乳腺癌MCF-7细胞的放射增敏作用。结果FePd纳米颗粒成功地通过化学还原方法被修饰在CNTs的表面。FePd@CNTs对MCF-10A细胞显示低细胞毒性(IC50＝738.3 μg/m)，同时可有效增强X射线对MCF-7细胞的杀伤(增敏比为1.22)。结论FePd@CNTs具有对乳腺癌的治疗作用与放射增敏的潜力。

简介：摘要目的验证天然状态间充质干细胞来源的外泌体（MSC-exosome）治疗小鼠急性移植物抗宿主病（GVHD）的效果和可能机制，探索并建立定向基因修饰MSC-exosome的方法并验证修饰后MSC-exosome的功能。方法构建小鼠急性GVHD模型，观察比较不同剂量MSC-exosome组和MSC组的生理指标评分、生存和体重减低程度；进而通过体外T细胞活化实验和体内OVA抗原特异性T细胞活化实验检测比较组间活化T细胞的增殖水平。构建重组表达载体，获得携带PD-L1和PD-L1-ITGB1的AAV2YF3突变体，进而感染人MSC，分离获得其外泌体。检测比较天然状态和修饰后MSC-exosome在体外和体内对活化T细胞的增殖水平和调节性T细胞（Treg）比例的影响。结果①MSC-exosome（300 μg×3次）和小鼠MSC（1×106×3次）均能够有效改善急性GVHD小鼠的生理指标评分、生存和体重减低程度。②相比IL-2对照组，10、25、50 μg人MSC-exosome和1×106人MSC体外共孵育处理均能够抑制活化T细胞的增殖，增殖比例分别为86.0%（IL-2）、40.0%、39.6%、42.8%和41.0%；相比PBS对照组，50、100、200 μg小鼠MSC-exosome和1×106小鼠MSC在体内均能够抑制抗原特异性活化的OT-1细胞的增殖，增殖比例分别为42.6%、33.1%、14.2%、10.6%和14.6%。③携带PD-L1和PD-L1-ITGB1的AAV2YF3突变体定向修饰人MSC-exosome的表达率分别超过40%和60%。④相比天然状态，PD-L1和PD-L1-ITGB1定向修饰后MSC-exosome在体内对抗原特异性活化的OT-1细胞具有更好的增殖抑制效果；在体外亦能明显抑制活化T细胞的增殖，并诱导提高Treg的比例。结论MSC-exosome具有与MSC相似的免疫调节作用。经过PD-L1和PD-L1-ITGB1修饰后的MSC-exosome能够有效抑制活化T细胞的增殖，并且能够诱导提高Treg的比例。

简介：摘要目的分析血红素加氧酶-1(HO-1)修饰的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)联合常温机械灌注(NMP)对肝移植急性排斥反应大鼠肠道屏障功能的影响。方法无特定病原体4~5周龄、40~60 g雄性Brown Norway(BN)大鼠2只提取BMMSCs，通过腺病毒转导HO-1；24只7~8周龄、200~220 g雄性Lewis大鼠为供体，30只8~9周龄、220~240 g雄性BN大鼠为受体，"二袖套"法建立原位肝移植急性排斥反应模型。BN大鼠随机分为5组：Sham组仅开腹关腹；NMP组供肝NMP 4 h；BMP组供肝NMP 4 h+门静脉灌注BMMSCs；HBP组供肝同BMP组，但灌注HO-1/BMMSCs；FK506组供肝NMP 4 h，肝移植术后灌胃他克莫司，每组6只。术后第14天取材检测并计算排斥活动指数(RAI)，HE染色及透射电镜分别观察肠道病理改变和超微结构，Western印迹检测肠道组织紧密连接蛋白表达，酶联免疫吸附法检测血清脂多糖、D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)。结果HBP组、FK506组RAI为(2.80±0.84)分、(2.20±0.84)分，显著低于NMP组(7.60±1.14)分、BMP组(6.00±1.58)分，差异均有统计学意义(均P<0.05)。肠道HE染色NMP组肠绒毛明显稀疏、皱缩，排列杂乱，BMP组、HBP组、FK506组较NMP组肠道损伤程度减轻。电镜观察HBP组肠上皮细胞微绒毛丰富且排列整齐，细胞间紧密连接结构完整。Western印迹检测闭锁小带-1相对表达，HBP组(0.87±0.06)，高于NMP组(0.41±0.12)和FK506组(0.52±0.15)；闭合蛋白相对表达HBP组(1.28±0.26)，高于NMP组(0.27±0.18)和FK506组(0.63±0.22)，差异均有统计学意义(均P<0.05)。HBP组血清脂多糖、D-乳酸和DAO浓度均低于NMP组、FK506组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论HO-1/BMMSCs联合NMP可以保护肝移植术后急性排斥反应BN大鼠的肠道屏障功能。

简介：摘要目的验证天然状态间充质干细胞来源的外泌体（MSC-exosome）治疗小鼠急性移植物抗宿主病（GVHD）的效果和可能机制，探索并建立定向基因修饰MSC-exosome的方法并验证修饰后MSC-exosome的功能。方法构建小鼠急性GVHD模型，观察比较不同剂量MSC-exosome组和MSC组的生理指标评分、生存和体重减低程度；进而通过体外T细胞活化实验和体内OVA抗原特异性T细胞活化实验检测比较组间活化T细胞的增殖水平。构建重组表达载体，获得携带PD-L1和PD-L1-ITGB1的AAV2YF3突变体，进而感染人MSC，分离获得其外泌体。检测比较天然状态和修饰后MSC-exosome在体外和体内对活化T细胞的增殖水平和调节性T细胞（Treg）比例的影响。结果①MSC-exosome（300 μg×3次）和小鼠MSC（1×106×3次）均能够有效改善急性GVHD小鼠的生理指标评分、生存和体重减低程度。②相比IL-2对照组，10、25、50 μg人MSC-exosome和1×106人MSC体外共孵育处理均能够抑制活化T细胞的增殖，增殖比例分别为86.0%（IL-2）、40.0%、39.6%、42.8%和41.0%；相比PBS对照组，50、100、200 μg小鼠MSC-exosome和1×106小鼠MSC在体内均能够抑制抗原特异性活化的OT-1细胞的增殖，增殖比例分别为42.6%、33.1%、14.2%、10.6%和14.6%。③携带PD-L1和PD-L1-ITGB1的AAV2YF3突变体定向修饰人MSC-exosome的表达率分别超过40%和60%。④相比天然状态，PD-L1和PD-L1-ITGB1定向修饰后MSC-exosome在体内对抗原特异性活化的OT-1细胞具有更好的增殖抑制效果；在体外亦能明显抑制活化T细胞的增殖，并诱导提高Treg的比例。结论MSC-exosome具有与MSC相似的免疫调节作用。经过PD-L1和PD-L1-ITGB1修饰后的MSC-exosome能够有效抑制活化T细胞的增殖，并且能够诱导提高Treg的比例。

简介：背景：研究表明，干细胞治疗比药物治疗更接近于恢复患者的生理模式，细胞移植治疗已逐渐成为一种趋势。目的：观察酪氨酸羟化酶修饰的脐血间充质干细胞移植后帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量的变化。方法：将酶切鉴定后的新构建质粒pEGFP-C2-TH经电穿孔法转染第3代脐血间充质干细胞，注射到帕金森病大鼠右侧脑室，对照组注入PBS。观察移植细胞在大鼠脑组织内的迁移情况，高效液相色谱仪检测大鼠纹状体内多巴胺的含量。结果与结论：质粒pEGFP-C2-TH转染的脐血间充质干细胞移植后8周，细胞逐渐向脑室转移，12周时迁移至皮质，可表达酪氨酸羟化酶抗原，且实验组多巴胺含量明显高于对照组（P＜0.05）。结果表明酪氨酸羟化酶修饰的脐血间充质干细胞经脑室移植对帕金森病大鼠具有明显的治疗作用。

简介：

简介：摘要目的用响应面法对马来酰亚胺活化相对分子质量40 000的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)(MAL-PEG40K)修饰胰高血糖素样肽1类似物(glucagon-like peptide 1 analog，GLP-1a)的反应条件进行优化。方法对GLP-1a浓度、GLP-1a/MAL-PEG40K摩尔比、反应液pH值、反应温度、反应时长进行单因素试验。以前3个条件为自变量，PEG修饰率为响应值，根据中心组合试验设计原理，研究各自变量及其交互作用对PEG修饰率的影响。通过高效液相色谱法分析PEG修饰率，依据回归分析确定各反应条件的最优值。结果GLP-1a与MAL-PEG40K的最佳反应条件为：GLP-1a浓度2.5 mg/ml，GLP-1a/MAL-PEG40K摩尔比1∶1.25，反应液pH8，反应温度4 ℃，反应时长60 min。该优化条件下，GLP-1a的PEG修饰率可达91.0%。结论响应面法获得了GLP-1a与MAL-PEG40K的最佳反应条件。

简介：目的探讨肝细胞生长因子基因修饰自体骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死的可行性,并评价其疗效。方法对1例ARCOⅢB股骨头坏死患者,手术过程中局部注射肝细胞生长因子基因修饰的自体骨髓间充质干细胞1×10^7个,随访观察评价其临床疗效和影像学改变。结果治疗过程顺利,术后无感染及过敏等严重并发症发生。术后随访9个月,患者髋关节疼痛指数较治疗前明显降低,髋关节临床症状Harris评分分值由治疗前的63分提高到治疗后的76分,髋关节活动度Harris评分由治疗前分值2.5分提高至4.2分。CT扫描显示损伤局部出现重建性骨修复,低密度区范围缩小,密度增高。ARCO分期由ⅢB改善至ⅢA。结论肝细胞生长因子基因修饰的自体骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死,安全有效,本次探索为进一步临床研究奠定了基础。

简介：目的探讨转转化生长因子-β（TGF-β）基因的骨髓基质干细胞（BMSCs）在RGD多肽表面修饰的聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）材料上的增殖、黏附、分化情况，以研究TGF-β基因和RGD多肽在调控种子细胞生物学行为方面的作用。方法将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上，把TGF-β基因转入BMSCs，以单纯PLGA支架材料、单纯BMSCs作为对照，分别将单纯BMSCs和转TGF-β基因BMSCs两组细胞种植于两种材料上，培养1、2、3d后，计数细胞密度以反映细胞增殖情况；接种后4、12h，沉淀法定量检测黏附的细胞数；培养24h后用FITC连接的鬼笔环肽对细胞骨架染色，观察细胞骨架的组织情况；用成骨性培养基培养7、14、21d，检测细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性来了解BMSCs分化情况。结果转TGF-β基因细胞密度显著增大，且在各时间点有较高的ALP活性。RGD多肽修饰的PLGA材料上细胞黏附率高，并有较高的荧光素密度及较粗大的细胞骨架，且在第14天时表现出高的ALP活性。结论TGF-β基因和RGD多肽同时应用有利于BMSCs黏附到支架材料上，并能促进其增殖和向成骨细胞方向分化。

简介：摘要目的对上转换纳米颗粒进行表面修饰，以利于生物应用。方法利用热分解法合成NaYF4: Yb, Er粒子，然后采用微乳液法在粒子表面包覆一薄层SiO2，并在其表面修饰环氧基团，采用透射电子显微镜、荧光光谱仪和傅里叶红外光谱分析仪分别对颗粒形貌、发光特性和表面性能进行表征。结果采用热分解法合成了大小均一，六方相的NaYF4: Yb, Er颗粒，二氧化硅包覆纳米粒子后仍具有较强的发光特性，并进一步成功修饰上了环氧基团。结论上转换纳米粒子经过表面修饰后具有较强的发光特性和稳定性，可作为生物荧光标记物应用于生物医学领域。

简介：

简介：

简介：本研究观察腺病毒介导hPDGF—A／hBD2双基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（BM—MSC）体外以及移植后体内局部的外源基因表达情况。将已成功构建和包装的hPDGF—A／hBD2双基因共表达腺病毒体外感染原代分离培养的BM—MSC后，采用免疫荧光细胞化学法检测目的基因蛋白的表达。收集经重组腺病毒感染的BM—MSC的无血清培养上清，采用划痕试验检测培养上清中分泌的hPDGF—A的促迁移效应。将重组腺病毒感染的BM—MSC局部点状注射至大鼠放射创伤复合伤创面，在各时相点进行冰冻切片并观察创面移植的BMSC的分布，同时采用免疫组织化学的方法观察外源基因的表达。结果表明：在体外重组腺病毒感染后的大鼠BM—MSC表达报告基因EGFP。免疫荧光细胞化学检测显示双基因修饰的BM—MSC表达hPDGF—A和hBD2。划痕实验证实双基因修饰BMSC培养上清组在8、12、24和30小时的愈合面积百分比显著高于对照组（P〈0．05）。荧光显微镜观察大鼠创面移植的外源性基因修饰的BM—MSC显示，至少在移植后2周之内BM—MSC可以较高水平地表达以EGFP为指示的外源基因。创面免疫组织化学染色表明，外源基因从第3天开始表达，第7天达到高峰，第21天仍有少量表达。结论：hPDGF—A／hBD2双基因修饰BM—MSC在体外、体内均可使目的基因得到有效表达，成为hPDGF—A／hBD2双基因修饰BMSC促进难愈创面愈合的基础。

简介：摘要目的探讨白细胞介素17(IL－17)修饰的小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)对异体小鼠皮肤移植的影响及机制。方法(1)取5只BALB/c小鼠(均为雌性，4～8周龄，性别、鼠龄下同)，处死后取股骨、胫骨和肱骨，采用全骨髓密度梯度离心联合贴壁分离法分离纯化培养BMSC，取第3代细胞行形态学观察，该代细胞经成骨、成脂诱导分化鉴定。第4代细胞经干细胞表面标志物鉴定。取第3～6代BMSC，经终质量浓度50 ng/mL小鼠重组IL－17预处理5 d后，行形态学观察。取IL－17预处理的BMSC和未经IL－17预处理BMSC标记碳花青荧光染料(CM－Dil)，行形态学观察并计算标记率。(2)取45只C57BL/6J小鼠，按随机数字表法分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组13只、单纯BMSC组16只、BMSC＋IL－17组16只。在小鼠皮肤移植术前1 d，单纯BMSC组13只小鼠经尾静脉注射5×106个/mL未经CM－Dil标记的BMSC 0.1 mL，另3只小鼠经尾静脉注射5×106个/mL CM－Dil标记的BMSC 0.1 mL；BMSC＋IL－17组13只小鼠经尾静脉注射5×106个/mL未经CM－Dil标记的IL－17预处理的BMSC 0.1 mL，另3只小鼠经尾静脉注射5×106个/mL CM－Dil标记的IL－17预处理的BMSC 0.1 mL；PBS对照组13只小鼠经尾静脉注射0.1 mL PBS。取45只BALB/c小鼠作供体，将前述3组处理后的45只C57BL/6J小鼠作为受体，建立背－背全厚皮移植模型。于移植术后第2天，再次对3组小鼠注射与移植术前1 d一样的等量相应细胞或PBS。于移植术后第7天，分别取单纯BMSC组和BMSC＋IL－17组中注射CM－Dil标记的BMSC和CM－Dil标记的IL－17预处理BMSC的3只小鼠，脱颈处死后采用荧光显微镜观察BMSC的CM－Dil示踪并计数。于移植术后第6天拆除敷料后，从单纯BMSC组注射未经CM－Dil标记的BMSC的13只小鼠和BMSC＋IL－17组注射未经CM－Dil标记的IL－17预处理BMSC的13只小鼠及PBS对照组13只小鼠中选取7只小鼠，记录移植皮片的存活时间。于移植术后第8天，从3组剩余的6只小鼠中分别取3只小鼠进行移植皮片的大体观察，酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中γ干扰素、IL－10、转化生长因子β(TGF－β)的水平，流式细胞仪检测脾脏CD4＋CD25＋叉头翼状螺旋转录因子p3(Foxp3)＋调节性T细胞(Treg)比例，行苏木精－伊红染色观察移植皮片的组织形态。于移植术后第14天，取3组剩余3只小鼠同前行组织形态观察。对数据行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD检验。结果(1)培养5 d，经IL－17预处理的BMSC与未处理的BMSC形态和大小并无明显差别。(2)CM－Dil标记后，经IL－17预处理的BMSC与未处理的BMSC生长状态均较良好，标记率几乎可达100%。(3)移植术后第7天，单纯BMSC组小鼠皮片及邻近皮下组织CM－Dil标记阳性的BMSC数量为每100倍视野下(6.2±2.6)个，明显少于BMSC＋IL－17组CM－Dil标记阳性的IL－17预处理BMSC的每100倍视野下(15.0±5.3)个(t＝－2.962，P<0.05)。(4)单纯BMSC组和BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片的存活时间分别为(13.3±1.2)、(17.0±1.5)d，明显长于PBS对照组的(8.7±0.8)d(P<0.01)，而BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片的存活时间明显长于单纯BMSC组(P<0.01)。(5)移植术后第8天，PBS对照组小鼠移植皮片大部分发黑变硬且结痂坏死，单纯BMSC组小鼠移植皮片大部分存活良好，BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片均存活良好。(6)移植术后第8天，与PBS对照组相比，单纯BMSC组和BMSC＋IL－17组小鼠的血清中IL－10和TGF－β含量明显升高(P<0.01)，γ干扰素含量明显降低(P<0.01)；与单纯BMSC组相比，BMSC＋IL－17组小鼠的血清中IL－10和TGF－β含量明显升高(P<0.01)，γ干扰素含量明显降低(P<0.01)。(7)移植术后第8天，单纯BMSC组和BMSC＋IL－17组小鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg比例明显高于PBS对照组(P<0.01)，BMSC＋IL－17组小鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg比例明显高于单纯BMSC组(P<0.01)。(8)移植术后第8天，PBS对照组小鼠移植皮片可见大量炎性细胞浸润，表皮、真皮坏死；单纯BMSC组小鼠移植皮片可见局灶性的炎性细胞浸润，仅有轻微的表皮变性；BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片皮肤附属器存活完好，同时有血管形成。移植术后第14天，单纯BMSC组小鼠移植皮片可见广泛的炎性细胞浸润，并有较重的表皮变性和局灶性坏死；BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片可见局灶性的炎性细胞浸润和轻微表皮变性；PBS对照组小鼠移植皮片已完全坏死。结论IL－17可通过提高小鼠BMSC诱导免疫耐受的能力和增强BMSC的归巢能力，最终起到减轻异体皮片移植后免疫排斥反应，延长小鼠移植皮片存活时间的作用。

简介：

简介：摘要目的观察神经干细胞(NSCs)联合神经营养因子-3(NT-3)基因修饰嗅鞘细胞(OECs)移植对颅脑损伤(TBI)大鼠神经修复的作用。方法取新生乳鼠海马和嗅球原代培养NSCs及OECs并鉴定。用含NT-3基因的慢病毒载体转染OECs，构建NT-3基因修饰OECs(OECs-NT-3)。取50只体重(200±20) g SD成年雄性大鼠(山西医科大学实验动物中心)随机分为假手术组、模型组、OECs-NT-3移植组、NSCs移植组、OECs-NT-3联合NSCs移植组，分组后制作大鼠颅脑损伤模型，给予相应细胞移植处理。细胞移植后1、7、14、28 d行改良神经功能评分(mNSS)，并各时间点取脑组织，制备石蜡切片行苏木精-伊红(HE)染色，原位缺口末端标记法(TUNEL)检测，溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、p75免疫组织化学染色。结果大鼠mNSS评分：移植28 d，联合组[(4.00±1.05)分]与模型组[(8.50±1.43)分]、OECs-NT-3组[(5.50±1.35)分]、NSCs组[(6.00±1.49)分]比较，差异有统计学意义(t＝－7.997、－2.764、－3.464，P<0.05)，而OECs-NT-3组与NSCs组比较，差异无统计学意义(t＝－0.785，P>0.05)。HE染色示假手术组、模型组、OECs-NT-3组、NSCs组、联合组损伤灶细胞密度依次为(220±22)、(299±47)、(347±35)、(390±72)、(523±55)个/每高倍镜视野。联合组脑组织结构排列相对规整，损伤灶细胞密度较模型组、OECs-NT-3组、NSCs组显著提高，差异有统计学意义(t＝7.246、5.996、3.373，P<0.05)。p75及BrdU免疫组织化学提示两种移植细胞能持续存活且广泛分布在损伤灶周围。移植7 d，假手术组、模型组、OECs-NT-3组、NSCs组、联合组细胞凋亡指数依次为(1.67±0.17)%、(47.49±7.92)%、(31.22±3.97)%、(34.48±4.69)%、(18.17±3.13)%。联合组与模型组、OECs-NT-3组、NSCs组比较，差异有统计学意义(t＝5.963、4.470、5.012，P<0.05)。结论神经干细胞联合NT-3基因修饰嗅鞘细胞移植可减轻大鼠脑损伤后神经细胞凋亡，修补局部缺损，对神经功能的恢复具有显著促进作用。

简介：摘要目的探讨来那度胺(LEN)联合替莫唑胺（TMZ）对TMZ耐药性人脑胶质母细胞瘤系U251/TR细胞增殖、侵袭、耐药性及O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因表观遗传修饰的影响。方法将前期应用分步诱导法成功构建的U251/TR细胞分为二甲基亚砜(DMSO)组、LEN组、TMZ组及LEN+TMZ组，其中DMSO组不进行任何药物干预，LEN组、TMZ组、LEN+TMZ组分别按LEN 100 μmol/L、TMZ 200 μmol/L、LEN 100 μmol/L+TMZ 200 μmol/L浓度处理U251/TR细胞（给药1次/24 h)。处理后24、48、72、96 h时，采用磺酰罗丹明B比色分析法检测细胞增殖率；处理后96 h时，采用Transwell实验检测细胞侵袭能力，采用流式细胞术检测细胞增殖周期，采用Western blotting实验、免疫组化染色、免疫荧光染色检测细胞中MGMT水平，采用RT-PCR法检测细胞中MGMT mRNA水平，采用甲基化特异性PCR检测细胞中MGMT基因启动子区甲基化情况。结果处理后24、48、72、96 h时，LEN+TMZ组的细胞增殖率较TMZ组、LEN组、DMSO组均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。处理后96 h时，LEN+TMZ组的穿膜细胞数较其他3组均明显减少，G0/G1期细胞比例较其他3组均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；TMZ组及LEN+TMZ组细胞中MGMT蛋白、mRNA水平较LEN组、DMSO组均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；TMZ组及LEN+TMZ组中胞浆内MGMT表达呈强阳性或中等阳性的细胞数量较LEN组、DMSO组明显更少，MGMT荧光强度(+)较LEN组(+++)、DMSO组(+++)明显减弱。各组细胞中MGMT基因启动子区均为未甲基化状态。结论LEN单药对U251/TR细胞的增殖、侵袭无明显抑制作用，而LEN联合TMZ能抑制该细胞的增殖、侵袭并逆转其耐药性，但其机制与MGMT基因启动子区甲基化状态改变无关。

简介：摘要目的探讨肝细胞生长因子（HGF）修饰的人脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的作用及其机制。方法采用实验研究方法。取2021年2—5月于空军军医大学第一附属医院整形科行腹部手术的3名健康女性（10~25岁）废弃脂肪组织，采用胶原酶消化法获取原代ADSC，培养7 d，用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第3代ADSC，转染HGF慢病毒，培养5 d，采用成像系统观察细胞荧光情况并计算转染率。取第3~6代ADSC和第3~6代转染HGF的ADSC，均分别采用密度梯度离心法提取其外泌体，即为ADSC外泌体和HGF-ADSC外泌体。采用透射电子显微镜观察外泌体微观形态，采用流式细胞仪检测外泌体的CD9、CD63、CD81阳性表达。取24只6周龄雄性昆明小鼠，制作糖尿病模型后，在其背部制作全层皮肤缺损创面。按照随机数字表法将小鼠分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组和HGF-ADSC外泌体组，每组6只，分别作相应处理。伤后3、7、10、14 d，观察创面愈合情况并计算其愈合率，使用多普勒血流仪检测创基血流强度并计算伤后10 d创基相对血流强度百分比。伤后10 d，采用免疫荧光法检测创面中Ki67阳性细胞数，采用免疫组织化学法检测创面中CD31阳性染色且成管样结构的新生血管数，采用蛋白质印迹法检测创面中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）的蛋白表达并计算p-PI3K与PI3K比值及p-Akt与Akt比值。伤后14 d，采用苏木精-伊红染色法、Masson染色法分别检测创面皮肤组织缺损长度及胶原新生情况，并计算胶原容积分数（CVF）。样本数均为3。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Tukey检验。结果原代ADSC培养7 d，细胞呈梭形，生长密集后呈旋涡状排列。培养5 d后，第3代转染HGF的ADSC携带绿色荧光，转染率为85%。ADSC外泌体及HGF-ADSC外泌体微观形态相似，均呈囊泡状结构，平均粒径分别为103、98 nm，均呈CD9、CD63、CD81阳性。伤后3 d，4组小鼠创面的创周均红肿且有少量渗液；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创面逐渐缩小，其余3组创面缩小不明显；伤后10 d，4组创面均缩小、结痂；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面基本愈合，其余3组均有残余创面。伤后3 d，4组创面愈合率接近（P>0.05）；伤后7、10 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为13.11、13.11、11.89，12.85、11.28、7.74，P<0.01）；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为15.50、11.64、6.36，P值均<0.01）。伤后3 d，4组小鼠创基均无明显血运；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创基开始有微血管形成，其余3组创基仅创缘充血；伤后10 d，除PBS组创基仍无明显血运外，其余3组均有微血管形成；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创基血流信号强于其余3组且分布均匀。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创基相对血流强度百分比明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为23.73、19.32、9.48，P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中Ki67阳性细胞数及新生血管数均明显多于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为19.58、18.20、11.04，20.68、13.79、8.12，P<0.01）。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创面中eNOS蛋白表达水平明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为53.23、42.54、26.54，P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中p-PI3K与PI3K的比值及p-Akt与Akt的比值均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为16.11、11.78、6.08，65.54、31.63、37.86，P<0.01）。伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面皮肤中组织缺损长度明显短于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为20.51、18.50、11.99，P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中CVF明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为31.31、28.52、12.35，P值均<0.01）。结论人HGF-ADSC外泌体可增加创基组织新生血管形成，从而显著促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合，其机制可能与HGF-ADSC外泌体通过激活PI3K/Akt信号通路从而促进创面中eNOS的表达增高有关。

简介：摘要目的本研究旨在探讨绝经后女性骨质疏松症（osteoporosis，OP）中分泌型卷曲相关蛋白2（secreted frizzled-related protein-2，SFRP2）基因DNA甲基化对转录和蛋白表达的影响，及miR-152-3p对SFRP2基因甲基化水平调控的分子机制。方法选择2017年9月至2020年9月于衡水市人民医院骨科就诊的绝经后OP患者作为研究对象，并纳入同期在本院进行体检的200例自然绝经健康女性作为对照组。定量检测OP患者和对照组的SFRP2基因甲基化水平；采用定量实时聚合酶联反应检测SFRP2基因mRNA和miRNA-148a的相对表达量；使用酶联免疫吸附测定法检测SFRP2和DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase，DNMT1）的蛋白表达水平；使用miRNA-152-3p模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）及其阴性对照（mimic NC和inhibitor NC）处理SD大鼠成骨细胞，检测DNMT1表达水平和SFRP2基因甲基化水平。结果OP组的SFRP2基因甲基化水平为（3.87±0.76）%，显著低于对照组（6.36±1.44）%（t=4.632，P<0.001）；OP组的SFRP2基因mRNA表达量为3.35±0.79，显著高于对照组（2.28±0.52）（t=4.858，P<0.001）；OP组的SFRP2基因蛋白表达水平为（4.15±0.62）pg/ml，显著高于对照组（2.83±0.51）pg/ml（t=4.858，P<0.001）；OP组的miRNA-152-3p相对表达量为（3.14±0.76），显著高于对照组（1.63±0.51）（t=5.318，P<0.001）；SD大鼠成骨细胞转染miR-152-3p后，mimic组的DNMT1表达水平和SFRP2基因甲基化水平显著降低，inhibitor组的DNMT1表达水平和SFRP2基因甲基化水平显著升高（P<0.001）。结论miR-152-3p可通过DNMT1调控SFRP2基因甲基化水平并参与OP的发生发展。