简介:Thepurposeofthestudyistoestablishafluorescencequantitativereversetranscriptionpoly-merasechainresponse(FQ-RT-PCR)methodforthequantitativedeterminationofIL-2mRNAandIL-4mRNAinThcells,withwhichtheThcellsstatusofthepatientswithgynaecologicaltumorsandchronicrenalfailure(CRF)canbeanalyzed.IL-2cDNAandIL-4cDNAwereprepared,andtheplasmidpMD18carryingIL-2cDNAorIL-4cDNAfragmentwasconstructedandclonedasthetemplateforquantitativedetermination.Theprimersandprobeslabelledwith6-carboxy-fluorescein(FAM)and6-carboxy-tetrarnethylrhodamine(TAMRA)wereprepared,andtheexperimentalconditionswereoptimizedtosetuptheFQ-RT-PCRmethodforquantitativedeterminationofIL-2mRNAandEL-4mRNA.Thcellsenrichedfromperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)of20healthyvolunteers(HVs),16gynaecologicalbenign(GB)cases,18gynaecologicalmalignant(GM)tumorcasesand16chronicrenalfailure(CRF)patientsweretestedforIL-2mRNAandIL-4mRNAbyFQ-RT-PCR.Thehouse-keepinggeneβ-actinwasusedastheinternalcontrolgeneoftheexperiment.Thestandardcurveforlogconcentrationofseriesofquantitativetemplatesvsthresholdcycle(CT)wasestablishedbylinearregression,andthelinearrangewas102-107copies/μl.TheimprecisiontestshowedtheCVofinter-assayandintra-assayofahighcontentsamplebyFQ-RT-PCRwere7.8%and12.5%,respectively.TheCVofinter-assayandintra-assayofalowcontentsamplewere10.8%and19.5%,respectively.TheIL-2mRNAexpressionsinThofthepatientswithgynaecologicalmalignanttumor(comparedwiththeHVsandthepatientswithgynaecologicalbenigndisease)andinThoftheCRFpatients(comparedwiththeHVs)weredeclinedsignificantlyandatthesametimetheIL-4mRNAexpressionincreasedsignificantly(P<0.001).Asimple,sensitiveandaccurateFQ-RT-PCRmethodforthequantitativedetectionofIL-2mRNAandIL-4mRNAhasbeenestablished.TheIL-2mRNAandIL-4m
简介:摘要目的检测血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA拷贝数,分析乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)与血清免疫标志物的关系。方法采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清样本中HBV-DNA含量;同时酶联免疫吸附法(ELISA)检测HBV血清标志物(HBVM),并对检测结果进行分析。结果在HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)组(大三阳组)和HBsAg(+)HBeAg(+)组HBV-DNA阳性率分别为96.1%(298/310)和96.6%(28/29),病毒含量为1.85×108copies/ml;HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)组(小三阳组)和HBsAg(+)HBcAb(+)组患者血清HBV-DNA阳性率分别为44.2%(80/181)和82.9%(31/41),病毒含量为4.8×106copies/ml。血清中HBeAg与HBVDNA含量密切相关。结论荧光定量PCR在乙肝的诊断、判断传染性强弱及评价抗病毒治疗效果方面具有较大的临床应用价值。
简介:目的用荧光定量PCR(FQ-PCR)法对乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)进行检测,并探讨其临床实际应用价值。方法用FQ-PCR法检测HBV-DNA;用ELISA法检测HBV标志物;用全自动生化分析仪检测肝功能。结果外周血检测表明:HBV-e抗原阳性和HBV-e抗体阳性的乙型肝炎患者,HBV-DNA检测阳性率分别为98.0%和45.7%,含量分别为10^7.23±2.67和10^4.56±1.47拷贝/ml;临床各组别中,急性肝炎组HBV-DNA含量明显高于其他各组别(P<0.01);对慢性乙型肝炎,干扰素治疗组显示:对低拷贝量(<10^6拷贝/m1)的疗效尚可.对高拷贝量(≥10^6拷贝/m1)的疗效较差;拉米夫定治疗组表明:低拷贝量组略好于高拷贝量组,前3个月疗效比较好,但从第4个月皆开始出现耐药株,在治疗1年时发生率可达22.6%。治疗结束后6个月和12个月复查结果表明:拉米夫定治疗组复发率明显高于干扰素治疗组。结论实时FQ-PCR法可及时、准确的自动化检测出标本中拷贝数量,灵敏度、特异性、重复性明显优于RT-PCR,它对乙型肝炎的诊断,治疗方案的选择、调整和疗效预期具有比较好的实用价值。
简介:摘要本文通过荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR,分别对191例临床粪便样本进行GⅠ、GⅡ型诺如病毒的快速检测,优化反应条件,筛选出最优反应体系,对两种方法的特异性、灵敏性进行检测分析。发现两种方法均可较好的检测出GⅠ、GⅡ型诺如病毒。其中常规RT-PCR阳性样本数为142,检出率为74.34%,最低检出限为103copies/μl,标准曲线均呈现出良好的线性关系,扩增效率分别为101.336%、103.558%;荧光定量RT-PCR的阳性样本为163,检出率为85.34%,最低检出限为102copies/μl,批内、批间重复试验的标准差范围为0.10~0.59,变异系数范围为0.43%~2.84%,重复性良好。两种方法检出率有显著差异(P<0.05),且对星状病毒、腺病毒以及肠道病毒等均无交叉反应,GⅠ、GⅡ型诺如病毒之间也无交叉反应。荧光定量RT-PCR在灵敏度方面占优,建议在临床检测中应用。
简介:摘要新冠肺炎爆发,战“疫”是全世界面临的重要任务,而快速确诊是疫情防控的基础。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》以及《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南(第四版)》记载,利用实时荧光 PCR进行核酸检验是主要诊断手段。作为当下新冠肺炎确诊的“金标准”,实时荧光 PCR功不可没。但通过新闻报道,我们不难发现当前诊断依然存在确诊慢、假阴性等问题。何为实时荧光 PCR?为何还不能完全快速准确地诊断新冠?如何改进?今天我们就从专利的视角,聚焦实时荧光 PCR,为大家揭开其神秘面纱。
简介:摘要目的建立武乡病毒(wuxiang virus, WUXV)的实时荧光定量TaqMan反转录聚合酶链式反应(real-time RT-PCR)检测方法。方法从GenBank中下载WUXV的全部基因序列,使用MEGA-X完成多序列比对分析,选择针对S段基因高保守区设计的引物和探针,分别对检测反应的特异性、灵敏性和稳定性进行评价。结果建立的方法可以特异性地检测WUXV,并且与多种虫媒病毒无交叉反应;反应的灵敏度较高,最低检测下限为1 pfu/ml;同一样品重复检测循环阈值(Ct)的批间变异系数均小于1.00%;用本研究建立的TaqMan RT-PCR检测30批白蛉核酸样本,其中7批出现WUXV阳性扩增曲线。结论本研究建立了灵敏度高、特异性强、重复性好的TaqMan RT-PCR方法可用于WUXV的大批量样本筛查。
简介:ObjectiveToinvestigatetheoccurrenceandpossiblemechanismsofapoptosisincochlearepitheliumandspiralganglionneuronsaftermefloquinetreatment.MethodsWeusedquantitativeRT-PCRapoptosis-focusedgenearrays(96-well,84apoptosisrelatedgenes)toassesschangesofgeneexpressioninthecochlearbasilarmembrane(haircells-supportingcells)andspiralganglionneuronsofratcochlearorganotypicculturestreatedwith100μMmefloquinefor3h.ResultsSignificantup-ordown-regulationingeneexpressionwasdetectedin23genesinthecochlearbasilarmembrane,andin32genesinthespiralganglionneuronscomparedwithtime-matchedcontrols.Therespondinggenescouldbeclassifiedaspro-oranti-apoptotic,andweremainlyimplicatedintheBcl-2,Caspase,Card,IAP,TNFligand/TNFreceptor,Deathdomain/Deatheffectordomain,DNAdamage/p53,andNF-kappaBfamilies.Syntheticanalysissuggestedthatthesefamiliescouldberevisedtotwomajorpathwaysmainlyinvolvedinthedeathreceptor-mediatedsignalingpathwayandapoptoticmitochondrialpathway.Inaddition,itwasfoundthatnumerousanti-apoptoticgenessuchasBcl2a1,Birc1b,Birc3,Birc4,Bnip1,Cflar,Il10,Lhx4,Mcl1,Nfkb1,Prlr,Prok2,andTNFweregreatlyup-regulatedinthecochleartissue,whichmightimplytheco-existenceofprotectiveresponseinthecellsattheearlystageofmefloquine-induceddamage.
简介:(江苏省赣榆县疾控中心皮防所检验科江苏赣榆222100)摘要目的对比分析赣榆地区568例初诊为男性非淋菌性尿道炎患者(NGU)尿道分泌物、前列腺液、精液三种不同标本UU和CT的检测阳性率。方法运用荧光定量聚合酶链反应法(FQ-PCR)检测568例男性NGU的尿道分泌物、前列腺液和精液进行检测。结果尿道分泌物标本中UU、CT、UU+CT的阳性率分别为47.71%、29.58%和7.04%;前列腺为35.04%、19.72%和4.75%;精液为32.92%、17.25%和3.52%。尿道分泌物与精液、前列腺液相同项目检测阳性率比较有显著差异(P<0.01)。精液与前列腺液之间检测的阳性率比较没有统计学意义(P>0.05)。结论尿道分泌物检测的UU、CT阳性率均最高,不同种类的标本检测的结果迥异,所以临床上检测男性生殖道UU、CT应首选尿道分泌物。
简介:目的:探讨乙肝表面抗原(HBsAg)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测呈灰区、弱阳性样本采用荧光定量PCR(FQ-PCR)的复检情况。方法:选取2012-01-2014-12无偿献血者血液标本为研究对象,将献血者分为3组,A组:ELISA检测HBsAg阴性(S/CO〈0.3)标本200例;B组:ELISA检测HBsAg灰区(0.7≤S/CO〈1)标本792例;C组:ELISA检测HBsAg弱反应性(1≤S/CO〈3)标本417例。结果:B组FQ-PCR复检21例(2.65%)HBV-DNA浓度〉100IU/ml;C组FQ-PCR复检20例(4.80%)HBV-RNA浓度〈100IU/ml;ELISA双试剂灰区HBV-DNAFQ-PCR阳性率高于单试剂灰区,差异有统计学意义(P〈0.05);ELISA双试剂弱反应性HBV-DNAFQ-PCR阳性率与单试剂弱反应性比较差异无统计学意义(P〉0.05)。结论:ELISA检测HBsAg为灰区、弱反应性标本存在一定的HBV-DNA阳性标本漏检和误诊,这部分血样采用FQ-PCR检测可提高输血安全,避免血源浪费。
简介:目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×10^2拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.99918。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测
简介:【摘要】:新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒 (2019-nCoV)引起的一种急性的呼吸道传染疾病,可迅速发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍,严重威胁患者的生命健康安全。经相关学者对新型冠状病毒毒株的检验研究后,确认通过实时荧光 RT-PCR核酸检测可对新型冠状病毒进行临床诊断,可以早发现、早诊断、早治疗或尽早与其他病毒感染者进行鉴别诊断。
简介:摘要随着时代的进步,社会的发展,大多数疾病已经可以得到很好的治愈,但是大规模的流感病毒的爆发,仍然困扰着我们,特别是甲型H1N1流感。流感病毒传染性强,变异性强传播速度快,爆发后难以控制,极大的危害了社会的安定和谐,,影响了人们的生活质量。所以及早点了检测发现流感病毒是抑制病毒传播,控制流感病毒爆发程度的最为关键的步骤。现在国内外常用的检测流感病毒的方法主要有血清学检测、核酸扩增法检测、细胞培养法、流感病毒抗原检测法等。但是这些常用的方法耗费大量时间和精力,不适用于流感病毒的快速检查。相反,荧光定量RT-PCR是各种检测方法中最灵敏、最有效、最准确的。所以对于荧光定量RT-PCR检测流感病毒的应用的研究是有很大医学价值。
简介:随着现代分子生物学技术的发展,反转录聚合酶链式反应技术在甘薯病毒检测上的应用越来越广泛。采用该技术可检测出甘薯组织中含量极低的病毒RNA,具有灵敏度高、特异性强等优点。在本研究中根据NCBIGenBank中收录的SPCSV病毒外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了3对特异性引物,使用天根生化科技(北京)有限公司生产的QuantOneStepRT-PCRkit试剂盒,针对影响扩增产物的影响因素退火温度进行优化,建立了甘薯退绿矮化病毒的RT-PCR检测方法。该方法使RT-PCR在一管内完成,大大降低了外源物质的污染及RNA降解的几率,可作为甘薯SPCSV病毒的快速检测方法。
简介:Abstract:TheP24antigentest,HIVRNAPCRtest,HIVisolation/cultureandfourth-generationHIVuniformAg/AbassayarebeingutilizedindiagnosingacuteHIVinfectionindifferentlabs.ManyfactorslimittheuseofscreeningforacuteHIVinhigh-riskpopulations,inblooddonorsandduringvoluntaryHIVtesting,including,cost,technique,sensitivityandspecificity.InthisreviewweexploreanewNAATmethodwhichinvolvesHIVRNART-PCRonpooledsamples.Thistechniqueisabletoscreenforacuteinfectionsinalargetestingvolumeandmayheusedasascreeningmethodinhigh-riskpopulationsandblooddonors.