简介:摘要目的针对如何提高流式分选试验分选得率和纯度的问题,建立高效的流式细胞分选条件,为流式分选技术应用提供参考依据。方法2019年10月至2020年6月设计以BD FACS Sorp Aria II为例,首先以微球样品作为研究对象,经检测不同分选速率、不同分选模式及不同喷嘴条件下的分选结果,分析其影响因素,并以优化的条件尝试高效分选naïve T细胞。结果70 μm喷嘴,purity模式下,flow rate 1.0、3.0、5.0、7.0 4种速率的分选纯度均达到98%以上,但flow rate值越高,分选得率越低。不同分选模式分选时,yield模式的分选效率和得率都是最高的,分别为(99.67±0.33)%、(79.78±7.14)%,但其纯度显著低于另2种模式(均P<0.05)。3种喷嘴条件下分选后的纯度均达到98%以上,且得率差异无统计学意义(P>0.05)。结论分选原代naïve T细胞,70 μm喷嘴,flow rate1.0,purity模式条件最合适。
简介:摘要肝癌干细胞(LCSCs)定义为存在肝癌组织中一小部分具有自我更新能力和异质分化潜能的细胞。随着对肝癌发生机制研究的深入,肝癌干细胞驱动理论作为致癌机制之一被提出,而肝癌干细胞的研究重中之重就是如何分选及培养。目前,肝癌干细胞的分选主要基于与非肝癌干细胞的免疫表型和功能特性的差异:利用细胞表达生物标志物分选的方法有荧光激活细胞分选法(FACS)、免疫磁珠分选法(MACS)、激光捕获显微镜切割技术(LCM)等;基于功能特性分选的方法有边缘群细胞分选法、密度梯度离心富集法、无血清培养肿瘤球形成法、荧光标记保留法等,以及待进一步研究的更有利于肿瘤干细胞分选的微流控技术及三维细胞培养体系。本文将对近年来肝癌干细胞的分选方法做一个综述,探讨未来肝癌干细胞分选的研究趋势。
简介:目的探索多参数分选,以获得高纯度表皮干细胞(humanepidermalstemcells,hESCs)方法的可行性.方法收集3岁~6岁健康幼儿包皮,以DispaseⅡ和Tropsin分离、收集原代表皮细胞(5例),利用流式细胞仪(FACS)分别进行多种参数分选,即:CD49f+/CD71-表型的细胞分选;直径小于10微米的细胞分选.以及多参数复合分选,即:CD49f+/CD71-且细胞直径小于10微米细胞.对各组分选细胞及未分选细胞进行克隆形成率、细胞最大扩增能力、克隆形成面积的检测比较.计算各种分选方法所对应的细胞回收率.结果单参数分选的两组细胞之间在克隆形成率、细胞最大扩增能力、克隆形成面积三方面无统计学差异(p>0.05).多参数分选得到的细胞与通过单参数分选的两组细胞均存在统计学差异(p<0.05).结论利用多参数分选,能获得纯度更高的干细胞表型的表皮细胞.
简介:目的本研究主要比较了应用免疫磁珠(MACS)和流式细胞仪(FACS)两种分选手段,从ES分化细胞中获得血管平滑肌细胞和内皮细胞的效率。方法利用MACS和FACS从ES分化细胞中分选出FLK-1阳性细胞,分别在VEGF和PDGF诱导培养下获得血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,运用MACS和FACS进行细胞性质和纯度鉴定,并对两种方法所获细胞的活力和细胞得率进行比较研究。结果利用MACS分选获得的FLK-1阳性细胞经过PDGF诱导培养后可以得到108~109量级和纯度超过90%的血管平滑肌细胞,可满足构建血管的需要,而利用FACS分选难以获得构建血管肌层所需的大量细胞。利用FACS分选的FLK-1阳性细胞经过VEGF诱导培养后的纯度约60%,表达vWF和吸收低密度脂蛋白(Ac-LDL)的血管内皮细胞;而利用MACS从ES细胞中分选获得的血管内皮细胞纯度较低,两种分选方法获得的细胞活力无明显差别。结论因组织工程血管构建所需要的平滑肌细胞数量巨大,宜选用MACS从ES分化细胞中分选获得;而血管内皮细胞宜选用FACS分选获得。
简介:目的用流式细胞仪分选培养人真皮来源淋巴管内皮细胞,研究其生物学特点。方法采用中性蛋白酶及胶原酶消化包皮组织获得真皮细胞悬液.应用流式细胞仪检测和分选Podoplanin+和Podoplanin-/CD34+细胞.所获细胞进行体外培养。传代细胞进行免疫荧光及RT-PCR方法检测LECs特异标志的表达,低密度脂蛋白吞噬、鼠尾胶原三维培养检测功能特点,MTT法及氚标记法测定细胞增殖周期和低氧条件对其增殖的影响。结果人真皮细胞中CD31+,CD34+和Podoplanin+细胞所占比例分别是6.0%,4.4%和1.4%。Podoplanin+CD34+细胞在单层培养时形成内皮细胞典型的铺路石样外观,表达内皮细胞特异性标志CD3l及吞噬DiI-Ac-LDL和三维培养微管形成功能。Podoplanin+细胞表达淋巴管内皮细胞特异性标志Prox-1,Ang2和VEGFIR-3.和CD34+细胞间具有显著性差异。两组细胞生长曲线相似均于接种至培养板后的3~5d逐渐进入对数生长期,接种后的6—8d均进入停滞期。在缺氧环境下,氯化钴浓度为50μM和100μM时刺激细胞增殖,当浓度大于200μM细胞增殖明显受到抑制。结论应用流式细胞仪可以富集人真皮来源淋巴管内皮细胞和血管内皮细胞.尽管两者表达特异性分子标志不同,其在三维培养和缺氧条件下生长特点相似.
简介:摘要目的探讨分选蛋白(SNX)17通过激活表皮生长因子受体(EGFR)影响胰腺癌细胞侵袭、增殖和迁移能力。方法采集3例人胰腺癌组织及癌旁组织样本,自2021年1月至2021年3月收集于贵州医科大学附属医院肝胆外科,用免疫组织化学(IHC)染色检测癌组织与癌旁组织中SNX17的表达量。用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测胰腺癌细胞系中SNX17的相对表达量;用空siRNA以及两种敲低SNX17的小干扰RNA(siRNA)分别转染上述细胞,分组为NC组、SNX17-si1组和SNX17-si2组。通过细胞计数试剂盒(CCK-8)、平板克隆实验检测胰腺癌细胞的增殖能力,Transwell及划痕实验检测胰腺癌细胞迁移能力。蛋白质印迹法(Western blot)检测在SNX17敲低的癌细胞中EGFR以及细胞外调节激酶(ERK)的相对表达量差异。最后在胰腺癌细胞中共转染siRNA以及EGFR的过表达质粒进行功能回复实验(分组为NC组、SNX17-si1组、EFGR-overexpression+SNX17-si1组),组间比较采用t检验,组内两两比较采用LSD-t检验。结果免疫组织化学检测结果显示癌组织中SNX17相对表达量高于癌旁组织(5.750±1.323,t=4.345,P<0.05),差异有统计学意义。RT-qPCR发现在胰腺癌细胞系中,人胰腺癌细胞-2(MIA PaCa-2,19.240±2.048、t=8.844,P<0.05)和人胰腺癌细胞-1(PANC-1,5.796±1.256,t=3.712,P<0.05)细胞中SNX17相对表达量显著高于其他胰腺癌细胞系,差异有统计学意义。CCK-8实验技术结果显示,SNX17-si1组、SNX17-si2组低于NC组吸光度值(0.707±0.059比0.346±0.075比1.109±0.052比0.602±0.047,t=12.060、4.642、21.440、12.750,P<0.01),差异有统计学意义。平板克隆结果显示转染组细胞集落数减少。划痕实验结果显示敲低SNX17降低细胞的侵袭能力。Transwell迁移实验结果显示,SNX17-si1组、SNX17-si2组单位视野穿过的细胞数低于NC组[(666.300±14.400)个比(574.300±10.800)个比(129.300±4.300)个比(93.700±3.100)个,t=46.260、53.220、29.850、15.450,P<0.01],差异有统计学意义。而侵袭实验结果表示,SNX17-si1组、SNX17-si2组单位视野穿过的细胞数低于NC组[(137.5±20.1)个比(100.8±17.4)个比(324.5±7.9)个比(289.8±10.2)个,t=6.836、5.807、41.020、28.430,P<0.01],差异有统计学意义。Western blot检测结果显示,SNX17-si1组与SNX17-si2组EGFR的相对表达量低于NC组(0.477±0.032比0.278±0.042比0.853±0.053比0.826±0.050,t=14.920、6.640、16.130、16.430,P<0.01),差异有统计学意义。在回复实验中,CCK-8、Transwell实验及划痕实验证明共转染EGFR-overexpression+SNX17-si1逆转敲低SNX17所导致的胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的降低。最后用Western blot结果表明,共转染组比较单独转染SNX17-si1的组别,EGFR的相对表达量分别增高(0.712±0.010、t=70.220,P<0.05;1.002±0.027、t=37.580,P<0.05),差异均有统计学意义。结论SNX17通过影响EGFR促进胰腺癌细胞MIA PaCa-2和PANC-1的增殖、侵袭、迁移能力。
简介:摘要目的富集裸鼠乳腺癌移植瘤中的乳腺癌干细胞并进行分选。方法将人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于20只裸鼠右侧腋窝皮下,观察肿瘤的生长情况,30 d后剥离肿瘤,对组织进行HE染色,并从组织中分离出肿瘤细胞。用含血清的DMEM培养液培养分离出的移植瘤细胞,观察移植瘤细胞的形态及生长情况;应用流式细胞分选仪检测移植瘤细胞中干细胞(CD44+ CD24-/low细胞)比例。用含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和B27细胞培养添加剂的无血清DMEM培养液培养移植瘤细胞,获得细胞微球体;应用流式细胞分选仪检测培养第10天微球体中干细胞比例,并根据细胞表面标志分选出干细胞。结果20只裸鼠皮下注入MDA-MB-231细胞9 d后,17只皮下出现肿瘤,肿瘤组织实质细胞多,间质少,瘤细胞呈条索样排列,细胞体积大,胞质丰富,细胞核大小不一,深染,核分裂象多见,核仁清晰,多形性明显。用含血清的DEME培养液培养移植瘤细胞24 h后,细胞开始贴壁,3 d后贴壁率达60%,7 d后细胞增殖加快,细胞形态更趋于一致,多呈梭形,和MDA-MB-231细胞形态无明显差异,其中干细胞比例为(0.10±0.02)%。用含细胞培养添加剂的无血清培养液培养移植瘤细胞后,细胞呈球样生长,第10天微球体中干细胞比例为(70.47±2.03)%。结论裸鼠皮下接种MDA-MB-231细胞能建立裸鼠乳腺癌异位移植瘤模型,分离出的移植瘤细胞经无血清培养能富集移植瘤中的乳腺癌干细胞,从而能分选出更多乳腺癌干细胞,为研究乳腺癌干细胞生物学特性提供基础。
简介:摘要目的探讨雄激素受体(AR)对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5+CK8+细胞的作用及其调控机制。方法采用流式细胞术从LNCaP细胞中分选CK5+CK8+细胞,使用慢病毒载体携带AR基因转入CK5+CK8+细胞。实验分为转入AR的AR CK5+CK8+组和转入空载体的V CK5+CK8+组,在1、10 nmol/L二氢睾酮(DHT)培养条件下,采用蛋白质印迹法检测AR、p-AKT和bcl-2蛋白的表达,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、细胞迁移实验和琼脂糖凝胶克隆形成实验检测AR对CK5+CK8+细胞生物学特性的影响。采用MTT法检测应用AKT信号通路活化抑制物LY 294002(LY)、γ-生育三烯酚(γ-TT)和(或)诱导AR表达的5-氮胞嘧啶(5-AZA)对CK5+CK8+细胞增殖的影响。结果AR基因转入CK5+CK8+细胞后,AR表达增强,p-AKT和bcl-2蛋白表达水平降低。在1、10 nmol/L DHT作用2、4、6 d后,AR CK5+CK8+组细胞较V CK5+CK8+组细胞增殖受抑制程度高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。DHT 1、10 nmol/L作用3 d后,AR CK5+CK8+组细胞较V CK5+CK8+组细胞迁移能力下降[迁移细胞数:(54±9)个比(113±21)个,(13±3)个比(34±6)个],差异均有统计学意义(t=4.450,P<0.01;t=5.157,P<0.01)。DHT 1、10 nmol/L作用3周后,AR CK5+CK8+组细胞较V CK5+CK8+组细胞成瘤能力弱[克隆数:(39± 7)个比(105±16)个,(41±6)个比(86±6)个],差异有统计学意义(t=6.631,P<0.01;t=8.662,P<0.01)。5 nmol/L LY+10 nmol/L 5-AZA、5 nmol/L LY+5 nmol/L γ-TT、10 nmol/L 5-AZA+5 nmol/Lγ-TT、2.5 nmol/L LY+5 nmol/L 5-AZA+2.5 nmol/L γ-TT联合1 nmol/L DHT或10 nmol/L DHT作用2、4、6 d均能抑制CK5+CK8+细胞增殖(均P<0.05)。结论AR可以抑制从LNCaP中分选出的CK5+CK8+细胞增殖,导致细胞迁移和成瘤能力下降;其可能通过抑制AKT-bcl-2信号通路的活化而发挥作用。