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  • 简介:目的:悬浮细胞转染较贴壁细胞存在一定难度,用多聚赖氨酸包被细胞培养板培养悬浮细胞使其贴壁,用脂质体2000按照贴壁细胞转染方法转染悬浮细胞,提供一种高效转染悬浮细胞方法。方法:悬浮细胞Jurkat或CCRF-CEM培养于包被了0.1mg/mL多聚赖氨酸细胞培养板,16h后洗掉未贴壁细胞,用脂质体2000分别将pWPXLd质粒或靶向人ABL1基因小干扰RNA(siRNA)转染细胞,24h后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,鉴定质粒转染效率,或用Western印迹鉴定siRNA干扰效率。结果:pWPXLd成功转染2种细胞,siRNA成功抑制了ABL1表达。结论:质粒和siRNA均能成功转染,提供了一种高效可行转染悬浮细胞方法。

  • 标签: 悬浮细胞 转染 多聚赖氨酸 小干扰RNA 白血病
  • 简介:目的:探讨尼古丁在诱导小鼠肺泡巨噬细胞自噬及肺炎发生作用。方法:通过碘化丙啶(PI)/Hoch.est33258染色法检测尼古丁诱导巨噬细胞MH-S死亡;通过Western印迹和电子透射显微镜检测尼古丁诱导MH-S细胞自噬发生;采用中性红摄取实验检测尼古丁处理后巨噬细胞吞噬能力;通过攻毒实验检测尼古丁诱导肺炎。结果:不同浓度尼古丁作用下PI染色死细胞呈上升趋势;LC3BⅡ蛋白表达具有尼古丁剂量依赖性,并且1μmol/L尼古丁能够增强LPS预刺激MH-S细胞自噬发生。电子透射显微镜结果显示在1μmol/L尼古丁作用下,细胞内自噬体数量增加;MH-S中性红摄取能力与尼古丁浓度剂量呈负相关性;尼古丁能够诱导小鼠发生肺炎,并降低小鼠体重。结论:尼古丁能够增强肺泡巨噬细胞自噬水平,并且可以诱导肺炎发生,有助于进一步研究吸烟与肺炎关系。

  • 标签: 尼古丁 巨噬细胞 细胞自噬 肺炎模型
  • 简介:LBD基因家族是植物所特有的一类转录因子,在植物生长发育过程起到非常重要作用。本研究利用生物信息学方法,从萝卜基因组鉴定出分布于9条染色体上59个LBD基因。该家族成员结构比较简单,内含子数均不超过3个。萝卜LBD基因可分为两大类,分别包含50个和9个成员。它们在染色体上分布不均匀,1号染色体上基因数目最多,有18个,而7号和8号染色体分别仅有1个LBD基因。对它们在不同组织和发育时期表达模式研究发现,该基因家族具有一定时空表达特异性,预测其参与萝卜不同发育过程。本研究为萝卜LBD基因家族功能分析奠定了基础。

  • 标签: 萝卜 LBD基因家族 系统进化 基因表达
  • 简介:目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1表达水平;用Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果。结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化KCNN1。结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白体外表达提供了一套可借鉴实验方法。

  • 标签: 小电导钙激活钾离子通道蛋白1 杆状病毒/昆虫细胞表达系统 表达 纯化
  • 简介:目的:探讨生长激素(growthhormone,GH)对实验大鼠牙齿移动过程血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在牙周组织中表达影响方法:将40只7周龄大雄性Wistar大鼠根据是否注射生长激素分为实验组(E)和对照组(C)。将50g力值加于近左侧上颌第一磨牙:E组和C组分别腹部皮下注射GH(0.15IU/公斤/天)及等剂量生理盐水:大鼠分别在第1、3、7、14和21天处死。上颌第一磨牙及其牙周组织切片行VEGF免疫组织化学染色,并进行图像分析和统计:结果:无论张力侧及压力侧VEGF在实验组表达量均高于对照组,第3天组张力侧及压力侧实验组平均光密度值分别为174.47土7.53和345.80+25.46与其各自对照组相比较数据具有统计学意义(P<0.05),两侧实验组VEGF表达强度峰值均出现在第7天,分别为669.97+3.22和923.77+18.41差异具有统计学意义(P

  • 标签: 生长激素 牙齿移动:VEGF 正畸
  • 简介:荧光定量PCR(qRT-PCR)是研究分子生物学基因表达一种新型核酸定量技术,具备快速高效、特异性强、重复性好、灵敏度高和自动化程度高等优点,因而根据相应实验材料选择适宜内参基因对于提高qRT-PCR分析准确性显得尤为重要。Actin基因表达范围广且表达稳定,常常作为内参基因应用于qRT-PCR表达分析。前期利用转录组测序(RNA-seq)技术获得了西葫芦低温弱光转录组数据库,本研究从中筛选到1条长达2543bpcDNA,并对其进行了序列分析。生物信息学分析结果表明,该序列包含1个开放读码框(ORF),大小为2064bp,预测编码氨基酸数为682个,理论分子大小约为79.67kD,蛋白质等电点为6.28。WolfPsort分析发现,CpActin蛋白亚细胞定位于细胞核。MotifScan分析显示,CpActin蛋白质氨基酸序列207~406位和558~682位分别为Actin端和C端保守区域。同源性分析表明,基因编码蛋白质与同为南瓜属中国南瓜和印度南瓜同源蛋白相似性达到99%,具有高度保守性。基于所获得基因全长cDNA序列,设计了基因ORF全长引物对CpActin-F、CpActin-R,经PCR扩增得到一条特异、明亮条带,经测序验证,序列与RNAseq数据库cDNA序列一致,基因命名为CpActin,GenBank登录号为MH211008。在此基础上,设计了一对荧光定量PCR引物CpActin-Fq、CpActin-Rq,分析显示,该引物具有较高特异性和扩增效率,且在西葫芦不同组织(根、茎、花和果)和不同胁迫处理[正常(25℃,300μmol/m^2·s)、低温处理(4℃,300μmol/m^2·s)、弱光处理(25℃,80μmol/m^2·s)、低温弱光处理(4℃,80μmol/m^2·s)、强光处理(25℃,2000μmol/m^2·s)和高温处理(38℃,300μmol/m^2·s)]叶片中均能稳定表达,适合在西葫芦基因qRT-PCR表达分析研究作为候选内参基因。

  • 标签: 西葫芦 内参基因 CpActin 表达分析
  • 简介:目的:利用慢病毒载体建立稳定表达猪载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(pAPOBEC3F,简称pA3F)PK15细胞系。方法:以实验室前期构建pBPLV-flag-pA3F质粒为模板,PCR扩增pA3F基因,克隆到pLenti-Puro-3Flag载体构建成pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒,Western印迹鉴定其在HEK293T细胞表达;将pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒与包装载体共转染HEK293T细胞,包装成Lenti-pA3F慢病毒并测定病毒滴度;将Lenti-pA3F慢病毒感染PK15细胞,通过嘌呤霉素压力筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达pA3F细胞单克隆株,最终Western印迹检测细胞单克隆株pA3F表达。结果:菌落PCR和序列测定表明pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒构建正确,Western印迹显示该质粒可在HEK293T细胞中表达pA3F蛋白;包装了Lenti-pA3F慢病毒,滴度为1.32×10^8TU/mL,慢病毒感染PK15细胞后可检测到pA3F蛋白表达;经Western印迹鉴定,筛选得到单克隆细胞可稳定表达pA3F蛋白。结论:建立了稳定表达pA3FPK15细胞单克隆株,为进一步深入研究猪内源性反转录病毒在pA3F作用下免疫逃逸机制奠定了基础。

  • 标签: 猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F 慢病毒载体 猪内源性反转录病毒
  • 简介:目的:外泌体是活细胞分泌来源于多囊泡体膜性囊泡,其主要作用包括携带与运输。雪旺细胞是周围神经再生中非常优秀种子细胞,但其迁移能力较差,影响修复效果.本文旨在探讨外泌体和雪旺细胞共培养是否可以促进雪旺细胞迁移.方法:本实验通过分离纯化人脐带干细胞外泌体和大鼠坐骨神经雪旺细胞并鉴定,随后将其共培养于Transwell小室观察雪旺细胞迁移率.结果:通过人脐带干细胞超高速离心法得到外泌体高表达干细胞标志物CD44(92.2±3.6%)、CD73(99.1±0.6%),并且低表达单核细胞表面抗原CD14(0.5±0.06%)以及造血千细胞表面抗原CD34(0.4±0.07%),外泌体鉴定高表达CD81和CD9;雪旺细胞培养鉴定纯度达(92.3±2.7)%;均符合实验要求。通过Transwell小室实验发现外泌体可以明显促进雪旺细胞迁移,并且具有一定剂量关系:结论:外泌体可以提高雪旺细胞迁移能力,从而使雪旺细胞在组织工程领域中应用产生巨大突破.

  • 标签: 外泌体 人脐带间充质干细胞 雪旺细胞 神经再生
  • 简介:目的:构建斑马鱼FOXP3A融合蛋白原核表达系统,诱导表达并制备多克隆抗血清。方法:选取斑马鱼foxp3a基因cDNA894bp特异区段(s-foxp3a),对该片段进行密码子优化后构建原核表达载体pET-32a-s-foxp3a,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白并纯化,纯化后蛋白免疫家兔,制备斑马鱼FOXP3A蛋白多克隆抗血清,4次免疫后取血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果:在16℃经0.5mmol/LIPTG诱导10h条件下,SDS-PAGE分析表明斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白以包涵体形式产生;间接ELISA检测结果显示,FOXP3A蛋白多克隆抗血清效价在1.6×10^5以上。结论:制备了高效价斑马鱼FOXP3A多克隆抗血清,为进一步解析斑马鱼FOXP3A蛋白功能提供了基础工具。

  • 标签: 斑马鱼 FOXP3A 密码子优化 原核表达 多克隆抗血清
  • 简介:旨在评价薏苡属种质资源表型多样性,为品种改良和亲本选择提供科学依据。本文对108份薏苡属种质资源22个表型性状进行了多样性分析和分类。结果表明,全部材料涵盖了薏苡属2个种和4个变种,除了花药色表现一致,9个描述型性状(芽鞘色、叶鞘色、幼苗叶色、柱头色、幼果颜色、果壳色、喙有无、总苞形状、总苞质地)多样性指数在0.55~1.65之间,12个数值型性状(株高、着粒层、主茎粗、叶长、叶宽、总分蘖数、有效分蘖数、主茎节数、分枝节位、百粒重、粒长、粒宽)变异系数范围为13.0%~60.1%。相关分析发现,大部分数值型性状间存在显著相关性,而主成分分析将表型性状分为5个主成分,累积贡献率为77.4%。聚类分析将108份资源划分为3个类群,Ⅰ类主要分布在较高纬度地区,表现为植株矮小、叶片小、节数少和分枝节位低等特点;Ⅱ类主要分布在中国长江中下游、西南和南方地区及东南亚较低纬度地区,表现为植株高度、茎粗、节数及叶片大小等表现中等、分蘖数偏低等特点;Ⅲ类分布中国西南地区,主要表现为植株茎秆高大粗壮、叶片大、节数多和分枝节位高、分蘖多、生物量大等特征。大部分材料均表现出比较明显地域性和不同表型特征,可以作为薏苡新品种选育和改良优异亲本材料。

  • 标签: 表型 种质资源 多样性 薏苡
  • 简介:【目的】开展稻水象甲卵巢发育、扩散能力和防治药剂筛选研究,为云南稻水象甲防治提供依据。【方法】对成虫采用卵巢解剖法,确定卵巢发育进度和产卵期;采用田间系统调查法和染色法明确扩散范围;采用浸叶法对常用杀虫剂进行室内筛选。【结果】2009年4月下旬至5月上旬秧苗期,稻水象甲Ⅱ级卵巢达100%,Ⅲ级卵巢平均抱卵量为8粒·头-1,最大抱卵量为23粒·头-1。秧田返栽田幼虫、成虫虫口密度明显高于大田,秧田返栽田幼虫虫量是大田4.82倍,第一代成虫是大田6.50倍。烯啶虫胺、毒死蜱、辛硫磷、三唑磷、锐劲特对稻水象甲成虫防效在96.11%以上。【结论】滇中稻水象甲自然传播范围小,随稻秧移栽是稻水象甲主要传播方式,秧苗揭膜1周后至移栽前是化学防治关键期,建议选用烯啶虫胺、辛硫磷、三唑磷、锐劲特在此期间开展田间防控。

  • 标签: 稻水象甲 卵巢发育 扩散能力 药剂筛选
  • 简介:目的:建立无线粒体DNA(mtDNA)的人肺腺癌ρ^0A549细胞系。方法:在含50ng/mL溴化乙锭(EB)、100μg/mL丙酮酸钠和50μg/mL尿嘧啶核苷RPMI1640细胞培养基传代培养A549细胞;用低剂量EB连续诱导培养35d后,采用光镜观察、TaqMan探针法实时荧光定量PCR(qPCR)和Western印迹鉴定无mtDNAρ^0A549细胞系;采用MTT法测定ρ^0A549细胞增殖曲线。结果:倒置显微镜下野生型ρ^+A549细胞为多角形,ρ^0A549细胞形态呈拉长枝状;qPCR结果显示,低剂量EB诱导35dρ^0A549细胞无mtDNA存在。Western印迹结果显示,ρ^+A549细胞能表达核基因编码线粒体蛋白SDHA和ATP5A,也能表达线粒体基因组编码蛋白MT-COXI和MT-ATP6;ρ^0A549细胞无MT-COXI和MT-ATP6蛋白表达,但核基因编码SDHA和ATP5A蛋白能够正常表达。MTT结果显示,与ρ^+A549细胞相比,ρ^0A549细胞生长速度明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建和鉴定了无mtDNA的人肺腺癌ρ^0A549细胞系,为后续探讨mtDNA缺失或突变与人肺腺癌发生之间关系奠定了实验基础。

  • 标签: 线粒体DNA 缺失 肺腺癌 A549细胞系
  • 简介:目的:研究肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)对NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体信号通路调控作用机制。方法:利用免疫共沉淀和免疫印迹在HEK-293T细胞研究TRAF6与NLRP3相互作用;通过检测乳酸脱氢酶(LDH),在THP-1细胞研究TRAF6对NLRP3炎症小体信号通路活性影响。结果:TRAF6通过与NLRP3相互作用增加NLRP3稳定性,进而促进NLRP3炎症小体信号通路介导LDH释放。结论:TRAF6通过增加NLRP3稳定性正调控NLRP3炎症小体信号通路。

  • 标签: 肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6) NOD样受体蛋白3(NLRP3) 炎症小体 乳酸脱氢酶
  • 简介:【目的】紫茎泽兰是一种世界性恶性入侵杂草,侵入我国后迅速扩散至多个省市,严重阻碍了当地农、林、牧业发展。研究丛枝菌根真菌对紫茎泽兰生长和繁殖影响,解析土壤丛枝菌根真菌在紫茎泽兰入侵、传播和扩散过程作用,能为开展紫茎泽兰防控工作提供参考。【方法】通过盆栽实验,测定接种丛枝菌根真菌紫茎泽兰株高、叶片数、总叶面积、节间距、地径,并统计单株花序数、单花序种子量、种子量、种子千粒重、含水率、发芽率、发芽势、发芽指数等。【结果】丛枝菌根真菌对紫茎泽兰株高、地径有极显著影响(P<0.01),接种丛枝菌根真菌后,紫茎泽兰单株花序数、单花序种子数、总种子量分别增加了5.03、1.51、7.64倍;种子长度、宽度、含水率、发芽率、发芽势、发芽指数分别增加了15.24%、23.08%、19.46%、29.22%、391.01%、183.56%(P<0.05)。【结论】丛枝菌根真菌可显著促进紫茎泽兰生长,控制丛枝菌根真菌数量可有效抑制紫茎泽兰生长,并抑制紫茎泽兰花序数、种子量及种子生命力,降低其扩散蔓延速度。

  • 标签: 紫茎泽兰 丛枝菌根真菌 生长 繁殖
  • 简介:目的通过对甘肃,青海桃儿七遗传多样性研究,为野生桃儿七资源保护提供依据。方法采用ISSR分子标记技术,对13个野生桃儿七居群153份DNA进行扩增,对其扩增条带进行遗传多样性分析,在所得遗传距离基础上进行UPGMA聚类和Mantel检验地理距离,对野生桃儿七居群间遗传多样性差异进行分析。结果11条ISSR引物共检测到155个条带,每条引物10-17个,平均14.1个,共1320个多态性位点;居群平均多态性位点百分率(PPL)65.50%;Nei’s遗传多样性指数(H)为0.2101,Shannon信息指数(I)为0.3191;遗传距离变化范围0.0316-0.3769;Mantel检验p=0.4220。结论甘肃,青海13个野生桃儿七居群间具有较高遗传多样性,种群内基因流十分丰富,居群内遗传分化明显比居群之间分化要大,各居群间遗传距离与地理距离无相关关系。

  • 标签: 桃儿七 ISSR分子标记 遗传多样性 聚类分析 地理距离
  • 简介:【目的】随着香蕉枯萎病菌4号生理小种热带型(简称FocTR4))在云南入侵、传播和蔓延,对云南香蕉产业产生严重威胁。通过实时荧光定量PCR分析蕉园定植香蕉后7个月内土壤枯萎病病原菌TR4含量动态变化,明确不同香蕉品种大田抗性表现以及不同肥料防控效果,为枯萎病防控提供技术参考。【方法】选用巴西蕉、桂蕉1号、南天黄和自主选育云蕉1号为供试品种开展田间试验,设置虾肽有机肥+虾肽特护+虾肽果叶康(简称:虾肽有机肥处理)、常规有机肥+微生物制剂(简称:微生物处理)和常规有机肥(简称:对照)3个处理,调查4个品种在4个时间段枯萎病发病率和3种肥料防治效果。【结果】在月平均枯萎病病原菌TR4含量均超过2000拷贝土壤条件下,4个品种发病率在3个施肥处理均表现出差异性,南天黄、云蕉1号发病率与其他2个主栽感病品种发病率差异达显著水平;3种施肥处理间发病率达显著差异,发病率从高到低表现为对照>虾肽有机肥处理>微生物处理。【结论】施用微生物制剂对降低枯萎病发病率起一定作用。南天黄抗病性较强,云蕉1号也表现出较强抗性,但还有待进一步改良和提高抗性。

  • 标签: 香蕉枯萎病4号生理小种热带型 发病率 品种 微生物制剂
  • 简介:InDel在基因组分布密度仅次于SNP,可作为动植物群体遗传分析、分子辅助育种等研究领域有效分子标记。花生是世界范围内重要油料作物之一。目前,花生栽培种全基因组已经公布,为准确挖掘花生基因组信息提供了重要参考。本研究通过169份花生核心种质GBS(Genotyping-by-sequencing)测序和比对,共获得大小分布在1~14bp范围内10401个InDels。染色体Arahy.16上分布InDels最多,达741个;而在染色体Arahy.08上分布最少,有263个。参考基因组注释信息,仅有1167个InDels分布在功能基因相关区域。经GO注释,InDel分子功能主要包括催化活性(catalyticactivity)和结合(binding);生物过程主要涉及代谢过程(metabolicprocess)、单组织过程(single-organismprocess)和细胞过程(cellularprocess)。经KEGG通路分析发现,InDels所在基因区域功能主要与代谢相关。本研究开发出全基因组水平InDel标记,并做了相应功能分类和注释,为进一步分子验证和利用提供丰富基因资源。

  • 标签: InDels检测 InDels分布 功能分析
  • 简介:目的:以角鲨烯、山梨醇、吐温为组分,在琥珀酸缓冲液混和甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白制备复合佐剂Nano-fla,评价该佐剂对人二倍体狂犬疫苗免疫效果和安全性。方法:以人二倍体细胞制备狂犬灭活疫苗为抗原,BALB/c小鼠设置PBS对照组、全剂量疫苗组、半剂量疫苗组、低剂量佐剂组(含半剂量抗原+5μg鞭毛蛋白)、中等剂量佐剂组(含半剂量抗原+10μg鞭毛蛋白),免疫程序为在0、3、7d肌肉注射,并在首针免疫后第7、14d尾静脉采血分离血清,通过快速免疫荧光灶抑制实验检测中和抗体,通过酶联免疫斑点实验检测细胞因子水平。结果:首针免疫后第7d,中等剂量佐剂组中和抗体达保护效力水平,显著高于全剂量疫苗组和低剂量佐剂组;第14d时中等剂量佐剂组IgG抗体浓度显著高于全剂量疫苗对照组;第14d中等剂量佐剂组与全剂量疫苗组相比,分泌IFN-γ和IL-4淋巴细胞数量显著增加。结论:复合佐剂Nano-fla应用到狂犬疫苗,能有效刺激小鼠体液免疫和细胞免疫应答,更早地产生中和抗体,且能有效降低抗原用量,具有潜在应用价值。

  • 标签: 鞭毛蛋白 狂犬病疫苗 佐剂
  • 简介:大麻THCA合成酶基因CsTHCA在调控大麻THC含量方面起着重要作用。通过RT-PCR方法从大麻克隆了CsTHCA,该基因开放阅读框全长1638bp,共编码545个氨基酸。通过pSKint中间载体,构建CsTHCARNA干扰植物转化载体并转化大麻茎尖,获得转基因植株,通过分析大麻THCA合成酶基因表达并结合薄层色谱法和SPE-HPLC法发现,转基因植株基因表达量降低且THC含量降低,这表明CsTHCA通过某种机理正调控THC含量。

  • 标签: 大麻 CsTHCA RNA干扰 遗传转化
  • 简介:目的:利用喷雾干燥工艺制备芽孢杆菌dhs-330-021菌粉,并研究菌粉活性及稳定性。方法:以脱脂乳、海藻糖、β-环糊精和谷氨酸钠为保护剂,采用喷雾干燥(条件为:进口温度100℃,出口温度50~60℃,进样速度2~4mL/min)制备芽孢杆菌菌粉,以喷干存活率和菌粉活菌数为指标,选择最佳制备条件。结果:获得喷干保护剂配方为脱脂乳10.0%、海藻糖6.0%、β-环糊精13.0%、谷氨酸钠15.0%,喷干存活率为65.9%,菌粉活菌数为1.38×10^9CFU/g,存放180d后菌粉活菌数为1.03×10^9CFU/g。结论:喷雾干燥工艺可以用于芽孢杆菌dhs-330-021菌粉制备,获得菌粉稳定性较好。

  • 标签: 芽孢杆菌 菌粉 保护剂 喷雾干燥