简介:目的应用RevTet-Off系统,于体外观察四环素调节下凋亡素基因的表达及其对人肝癌细胞系HepG2的作用。方法将RevTet-Off基因调控系统的调节质粒pRevTet-Off和含凋亡素基因的重组表达质粒载体pRevTRE-VP3分别转染PT67细胞,包装出RevTet-Off和RevTRE-VP3重组逆转录病毒,依次将此两种病毒感染HepG2细胞,建立整合了RevTet-Off和RevTRE-VP3重组逆转录病毒的阳性细胞株HepG2/Off-VP3。通过四环素调节凋亡素基因在HepG2/Off-VP3中的表达,AnnexinV-FITC/PI双染色后,以流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果经RT-PCR证实凋亡素基因在HepG2/Off-VP3-8细胞得到了表达;HepG2细胞在无四环素环境下的细胞凋亡率明显高于1μg/mL四环素环境下的凋亡率。结论凋亡素基因经RevTet-Off系统导入HepG2细胞后,可在四环素调控下表达产生凋亡素并诱导细胞凋亡。
简介:目的探讨沉默甲壳质酶蛋白40(YKL-40)表达对子宫内膜癌顺铂(DDP)耐药细胞株Ishikawa/DDP的影响。方法采用DDP长期浓度梯度递增法体外建立Ishikawa/DDP耐药细胞株,并检测多药耐药相关基因(MDR1)和Bcl-2、Bax和caspase-3的表达,采用MTT法检测Ishikawa细胞和Ishikawa/DDP细胞的增殖活性,计算半数抑制浓度(IC50)。Ishikawa/DDP分别转染NC阴性序列(NC组)和siRNAYKL-40(si-YKL-40组),另设未转染细胞作为对照组,采用MTT法、划痕实验和AnnexinV/PE双染法检测DDP对si-YKL-40组Ishikawa/DDP细胞增殖、迁移能力和凋亡的影响。结果体外成功建立Ishikawa/DDP耐药细胞株,3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/LDDP对Ishikawa/DDP细胞的增殖抑制率分别为(6.93±2.45)%、(8.14±4.50)%、(11.37±4.62)%、(15.18±3.97)%、(26.29±5.08)%、(41.32±7.64)%,明显低于Ishikawa细胞(P<0.05)。DDP对Ishikawa和Ishikawa/DDP的IC50分别为14.58μmol/L和116.70μmol/L,Ishikawa/DDP的耐药指数为8.004。QPCR检测结果显示,Ishikawa细胞YKL-40、MDR1、Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA表达量分别为0.82±0.15、0.43±0.11、1.05±0.23、1.17±0.20、0.96±0.18,而Ishikawa/DDP细胞分别为1.87±0.40、2.34±0.46、1.52±0.28、0.72±0.21、0.49±0.17,差异有统计学意义(P<0.05)。3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/LDDP对si-YKL-40组细胞的增殖抑制率分别为(10.95±2.74)%、(18.73±5.30)%、(32.79±5.47)%、(52.28±6.58)%、(61.73±5.26)%、(65.45±7.33)%,明显高于对照组和NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。DDP对si-YKL-40组细胞的IC50为22.19μmol/L。与对照组和NC组比较,si-YKL-40组细胞凋亡率升高、愈合率下降;YKL-40、MDR1、Bcl-2蛋白表达量下调,Bax和caspase-3蛋白表达量上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论沉默YKL-40可显著提高Ishikawa/DDP细胞株对DDP的敏感性,并促进细胞凋亡,其具体机制可能与下调MDR1、Bcl-2表达,及上调Bax和caspase-3表达有关。
简介:目的探讨Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对非小细胞肺癌NCI-H23细胞干性的调控作用。方法以非小细胞肺癌NCI-H23细胞为对象,以糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂(CHIR-99021)和β-cateninsiRNA为干预剂,分别采用噻唑蓝比色法、体外干细胞成球培养、划痕实验及免疫印迹法检测其增殖能力、体外成球能力和迁移能力方面的改变。结果CHIR-99021作用24h后NCI-H23细胞的增殖能力、干细胞成球率均明显提升,与对照组的差异均有统计学意义(P〈0.05),划痕愈合时间缩短。CHIR-999021干预后的NCI-H23细胞、NCI-H23干细胞中,GSK-3β磷酸化显著降低,增殖细胞核抗原、CD133、乙醛脱氢酶1A1、Nanog、基质金属蛋白酶-2表达增加。β-cateninsiRNA沉默β-catenin后NCI-H23中CD133、乙醛脱氢酶1A1和Nanog表达减少,干细胞成球率也较对照组降低(P〈0.05)。结论Wnt/β-catenin通路参与了非小细胞肺癌NCI-H23细胞干性调节,这对于非小细胞肺癌的防治有一定价值。
简介:目的:研究黄芪甲甙是否通过NG-Kepl/ARE信号通路发挥抗氧化作用来抑制骨髓间充质细胞的凋亡。方法:培养Witar大鼠BMSCs,设立正常组和黄芪甲甙干预组。采用实时荧光定量RT-PCR方法测定Nrf-2以及GSH的基因表达,Wetmblot检测其蛋白表达。结果:TUNEL和流式结果表明黄芪甲甙有抑制BMSC凋亡的作用,50^g/L组作用较强,与ADR组比较差异有显著性。增加浓度抑制凋亡的作用增加不明显,ADR+AST(100|JLg/L、50|JLg/L)两组,细胞凋亡率差异无显著性。黄芪甲甙作用后明显降低NmmR-NA的表达,与ADR模型组比较差异有统计学意义。各组分别与阿霉素模型组比较差异均有统计学意义。结论:黄芪甲甙可以通过Nf-2表达调控细胞凋亡,可能是其抑制神经细胞氧化应激、发挥保护作用的机制之一。
简介:目的:研究细胞周期调控因子p16、p27和CyclinD1在分化型甲状腺癌中的蛋白表达情况,及其在分化型甲状腺癌发生发展中的作用。方法:应用免疫组化S—P法对40例分化型甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌和滤泡癌以及30例甲状腺腺瘤组织中p16、p27和CyclinD1的蛋白表达情况进行检测。结果:p16、p27和cyclinD1三种蛋白在40例分化型甲状腺癌的阳性表达率分别为57.5%、70.0%和62.5%;p16蛋白的阳性表达量与分化型甲状腺癌的颈淋巴结转移之间具有相关性(P〈0.05);p27蛋白的阳性表达量与分化型甲状腺癌的颈淋巴结转移和原发灶的大小及包膜侵犯之间具有相关性(P〈0.05);CyclinD1蛋白的阳性表达量与分化型甲状腺癌的颈淋巴结转移和原发灶的包膜侵犯之间具有相关性(P〈0.05);p16的阳性表达与CyclinD1的阳性表达之间具有相关性(P〈0.05),且呈负相关关系(rs=-0.283);p27的阳性表达与CyclinD1的阳性表达之间具有相关性(P〈0.05),且呈负相关关系(rs=-0.279)。结论:p16、p27和CyclinD1三种蛋白的异常表达共同参与了分化型甲状腺癌的发生发展,可能成为判断分化型甲状腺癌恶性程度、转移及预后的指标。
简介:目的:探讨在喉癌细胞株Hep-2中上调miRNAlet-7a的表达对高迁移率族蛋白(highmobilitygroupA,HMGA2)的作用机制以及对喉癌细胞增殖的影响。方法:合成miRNAlet-7a模拟体(let-7amimics)并采用阳离子脂质体法转染入Hep-2内;分别用流式细胞术和MTT法检测let-7a高表达对细胞凋亡和增殖的影响;实时荧光PCR(Real-timeqPCR)和Westernblot检测上调let-7a后对HMGA2表达的影响。结果:本实验将let-7amimics成功转染入Hep-2内,流式细胞术及MTT法检测显示Hep-2内let-7a的表达上调会抑制喉癌细胞的增殖,促进喉癌细胞的凋亡。RT-qPCR检测显示:let-7amRNA在空白组和阴性对照组(NC组)的表达水平明显低于实验组(P〈0.05);HMGA2mRNA在空白组、NC组的表达水平明显高于实验组(P〈0.01)。Westernblot检测细胞中HMGA2蛋白的表达显示:实验组HMGA2蛋白的表达量明显低于空白组和NC组(P〈0.01)。上述实验中空白组与NC组之间比较均无统计学差异(P〉0.05)。结论:let-7a能够显著下调HMGA2基因和蛋白的表达,抑制喉癌细胞的增殖,促进其凋亡,为喉癌基因靶向治疗提供坚实的理论基础。
简介:目的:探讨5拷贝低氧反应元件(5HRE)联合癌胚抗原启动子(CEAp)调控抑癌基因RAS相关域家族1A(RASSF1A)的慢病毒载体(LV-5HRE-CEAp-RASSF1A)对胃癌细胞SGC7901的体外抑制作用。方法:采用qRT-PCR方法检测空白对照组细胞SGC7901、阴性对照组细胞SGC7901/NC及慢病毒载体感染的实验组细胞SGC7901/5HRE-CEAp-RASSF1A中RASSF1AmRNA表达水平;通过CCK-8实验检测各组细胞的生长曲线;通过流式细胞技术检测各细胞的凋亡及细胞周期。结果:qRT-PCR结果显示,与其他组比较,实验组细胞的RASSF1AmRNA水平在低氧条件下明显升高(P〈0.01);CCK-8实验结果显示从第3天开始,低氧条件下实验组细胞的OD值开始低于其它各组细胞(P〈0.05);流式细胞检测结果显示与其它各组细胞比较,低氧条件下实验组细胞凋亡比例明显增加(P〈0.01),并且其细胞周期G1期的细胞百分比明显增加(P〈0.05)。结论:慢病毒载体LV-5HRE-CEAp-RASSF1A具有在低氧诱导下显著抑制胃癌细胞株SGC7901增殖的作用。
简介:目的探讨MKP3在胶质母细胞瘤(GBM)中表达以及MKP3高表达对GBM细胞增殖的影响及其分子作用机制。方法利用TCGA数据库分析GBM中MKP3表达及不同MKP3表达患者的生存情况;选取GBM细胞U-87MG分别转染si-MKP3和si-NC,利用MTT实验和EdU法流式细胞术检测U-87MG细胞增殖的变化情况;Westernblotting检测p-AKT、AKT、MKP3及GAPDH的蛋白表达;1μmol/LPI3K特异性抑制剂以及pCDH-MKP3过表达质粒验证PI3K/AKT-MKP3轴在U87MG细胞增殖中的作用。结果TCGA数据库分析显示,GBM组织中的MKP3表达显著高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05);MKP3高表达患者生存率显著低于MKP3低表达患者,差异亦有统计学意义(P<0.05)。MTT法结果显示,si-MKP3组细胞增殖活力为0.431±0.116,显著低于Si-NC组的0.986±0.056(P<0.05)。EdU法结果显示,沉默MKP3表达可显著抑制U-87MG细胞的增殖。PI3K/AKT信号通路抑制能够明显阻滞U-87MG细胞的增殖,过表达MKP3后可使U-87MG细胞增殖能力基本恢复。过表达MKP3并不会引起AKT的磷酸化增加。结论PI3K/AKT信号通路通过上调MKP3表达可以诱导U87MG细胞增殖,促进GBM发生发展。
简介:目的:探讨益气养阴小复方对SMMC-7721人肝癌细胞P53、N-ras基因的调控作用。方法:选取临床肝癌治疗常用的益气、温阳、补肾、养阴等扶正治法的代表药物,并根据阴阳治则理论将其分别配伍为益气养阴、温阳养阴及补肾(阳)养阴等复合方治法,分别煎成汤液,采取家兔灌胃给药后分离药物血清的方法制备药物血清,作用于体外培养的SMMC-7721人肝癌细胞,以正常家兔血清和维甲酸作对照。流式细胞仪分析p53、p21^ras基因蛋白表达,RT-RCR半定量观察P53及N-ras基因转录情况。结果:养阴组以及益气养阴、温阳养阴、补肾养阴配伍的小复方组细胞p53蛋白表达增强,p21^ras蛋白表达降低,其中,又以益气养阴小复方组的作用最为明显;益气养阴小复方组P53转录增强,N-ras转录减弱。结论:益气养阴小复方具有显著的调控SMMC-7721人肝癌细胞:P53、N-ras基因表达的作用。
简介:目的探讨微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)对丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶9(MAP3K9)的靶向调控作用及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法向对数生长期胃癌细胞株MGC-803转染miR-148a-3p模拟物(mimics组)和阴性对照(NC组),以未转染的MGC-803细胞为对照组;采用实时定量PCR(QPCR)检测各组miR-148a-3p水平以评价转染效率,MTT法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,分别采用QPCR和Westernblotting检测Bcl-2、Bax、caspase-3及MAP3K9mRNA和蛋白水平,同时采用双荧光素酶报告实验验证miR-148a-3p与MAP3K9的靶向作用关系。结果QPCR结果显示,对照组、NC组和mimics组的miR-148a-3p水平分别为1.021±0.123、1.087±0.196和2.854±0.368,与对照组和NC组比较,mimics组的miR-148a-3p水平升高(P<0.05)。mimics组MGC-803细胞的增殖活力较其余两组减弱(P<0.05)。mimics组MGC-803细胞凋亡率为(15.2±1.6)%,高于对照组的(3.5±0.9%)%和NC组的(4.5±1.1)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组和NC组比较,mimics组的MAP3K9和Bcl-2的mRNA和蛋白水平均下调,而Bax和caspase-3的mRNA和蛋白水平均上调(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实MAP3K9是miR-148a-3p的直接作用靶点。结论MiR-148a-3p可抑制胃癌细胞MGC-803的增殖并诱导其凋亡,可能通过靶向MAP3K9来发挥抑癌作用,调控miR-148a-3p/MAP3K9轴在胃癌防治中有一定应用前景。
简介:目的研究不同能量密度激光作用于姜黄素对人胃癌MGC-803的光动力学杀伤作用.方法5μmol/L姜黄素与胃癌MGC-803细胞共同培养后,分别用不同能量密度9.6J/cm2、19.4J/cm2、40.2J/cm2的波长为405nm的激光照射,用MTT法检测胃癌MGC-803细胞株的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率及细胞线粒体膜电位、细胞内活性氧(ROS)及Ca2+的变化.结果随着激光剂量增大,细胞的抑制率及凋亡率呈上升趋势.能量密度为40.2J/cm2的激光照射后,细胞株的增殖抑制率和凋亡率达到最大,分别达(44.93±3.61)%和(26.58±2.67)%,差异有统计学意义(P<0.05).随激光剂量增大,细胞内线粒体膜电位显著降低,细胞内活性氧和Ca2+显著增加,能量密度增加为40.2J/cm2时,细胞内线粒体膜电位降低至(66.2±5.8)%,细胞内活性氧升高至(115.7±5.8)%,细胞内Ca2+升高至(104.6+5.6)%,与其它组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论以405nm的激光照射,姜黄素对胃癌MGC-803细胞有杀伤作用,在一定范围内呈剂量依赖关系.