摘要
摘要目的探讨小鼠乳腺癌细胞(4T1)和小鼠腹腔巨噬细胞(PMs)共培养构成的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)促进4T1细胞侵袭的作用机制。方法(1)提取PMs并用小发卡RNA(shRNA)敲低PGC-1α蛋白表达：采用原代细胞提取的方法提取PMs，并用低表达PGC-1α的shRNA(sh-PGC-1α-1、sh-PGC-1α-2、sh-PGC-1α-3)转染细胞，然后用Western blot检测PMs[对照组(PMs组)、阴性对照组(sh-control)、sh-PGC-1α-1组、sh-PGC-1α-2组、sh-PGC-1α-3组]中PGC-1α蛋白表达水平，选取抑制效果最好的shRNA用于实验。所得低表达PGC-1α的sh-PGC-1α PMs为本实验所需。(2)验证TAMs中PGC-1α蛋白表达水平：利用Transwell建立PMs/sh-PGC-1α PMs和4T1细胞的共培养体系，得到TAMs/sh-PGC-1α TAMs。收集细胞并提取蛋白，用Western blot检测对照组(PMs组)、TAMs组、sh-PGC-1α TAMs组PGC-1α蛋白表达水平。(3)验证共培养体系中4T1细胞的侵袭、迁移、愈合能力：利用Transwell小室模型观察对照组(4T1组)、TAMs组、sh-PGC-1α TAMs组4T1细胞的侵袭、迁移数；利用创伤愈合实验观察对照组(4T1组)、TAMs组、sh-PGC-1α TAMs组4T1细胞的愈合情况。(4)验证共培养体系中PMs的PGC-1α对4T1细胞发生细胞上皮-间质转化(EMT)的影响：利用Transwell建立PMs /sh-PGC-1α PMs和4T1细胞的共培养体系，采用Western blot检测对照组(4T1组)、TAMs组、sh-PGC-1α TAMs组EMT相关蛋白E-cadherin(上皮标志物)及vimentin(间质标志物)的表达情况。多组实验数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。结果(1)对照组(PMs组)、阴性对照组、sh-PGC-1α-1组、sh-PGC-1α-2组和sh-PGC-1α-3组PGC-1α表达水平分别为1.00±0.00、0.96±0.06、0.43±0.04、0.35±0.07和0.38±0.08，5组比较，差异有统计学意义(F＝32.648，P<0.050)，其中，对照组(PMs组)分别与阴性对照组、sh-PGC-1α-3组比较，PGC-1α表达水平的差异均无统计学意义(P＝0.991、0.065)，但是，sh-PGC-1α-1组、sh-PGC-1α-2组PGC-1α表达水平均低于对照组(PMs组)(P＝0.014、0.045)，并且，sh-PGC-1α-1组、sh-PGC-1α-2组和sh-PGC-1α-3组的PGC-1α表达水平均低于阴性对照组(P＝0.015、0.018、0.035)。因此，选择对PGC-1α抑制效果最好的sh-PGC-1α-2进行后续实验。(2)对照组(PMs组)、TAMs组、sh-PGC-1α TAMs组PGC-1α表达水平分别为1.00±0.00、1.92±0.20和0.90±0.23，3组比较，差异有统计学意义(F＝10.294，P＝0.011)，其中TAMs组PGC-1α蛋白表达水平明显高于对照组(PMs组)和sh-PGC-1α TAMs组(P均<0.050)。(3)Transwell侵袭实验显示，对照组(4T1组)、TAMs组、sh-PGC-1α TAMs组比较，共培养24 h后穿膜的细胞数分别为(41.67±6.01)、(75.33±5.46)和(24.33±1.45)个，3组比较，差异有统计学意义(F＝29.668，P<0.050)，其中TAMs组4T1细胞的侵袭能力显著高于对照组(4T1组)和sh-PGC-1α TAMs组(P均<0.050)。Transwell迁移实验显示，对照组(4T1组)、TAMs组、sh-PGC-1α TAMs组共培养24 h后穿膜的细胞数分别为(55.67±12.13)、(97.67±8.45)和(30.67±6.49)个，3组比较，差异有统计学意义(F＝13.193，P<0.05)，其中TAMs组4T1细胞的迁移能力显著高于对照组(4T1组)和sh-PGC-1α TAMs组(P均<0.050)。创伤愈合实验显示，对照组(4T1组)、TAMs组、sh-PGC-1α TAMs组4T1细胞24 h的愈合率分别为(100.00±0.00)%、(135.98±5.18)%和(68.82±7.28)%，3组比较，差异有统计学意义(F＝42.435，P<0.050)，其中TAMs组4T1细胞的愈合能力显著高于对照组(4T1组)和sh-PGC-1α TAMs组(P<0.050)。(4)Western blot检测发现：对照组(4T1组)、TAMs组和sh-PGC-1α TAMs组E-cadherin表达水平分别为1.00±0.00、0.44±0.11和2.51±1.67, vimentin表达水平分别为1.00±0.00、2.20±0.15和0.36±0.10，3组比较，E-cadherin和vimentin表达水平的差异均有统计学意义(F＝87.295、79.058，P均<0.050)；组间两两比较显示，TAMs组E-cadherin表达水平显著低于对照组(4T1组)和sh-PGC-1α TAMs组(P均<0.050)，vimentin表达水平显著高于对照组(4T1组)和sh-PGC-1α TAMs组(P均<0.050)，而sh-PGC-1α TAMs组E-cadherin表达水平显著高于对照组(4T1组)(P<0.050)，vimentin表达水平显著低于对照组(4T1组)(P<0.050)。结论TAMs可促进4T1细胞的侵袭、迁移、愈合以及EMT过程，且该作用与TAMs的PGC-1α相关。
出版日期
2020年08月10日（中国期刊网平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
