简介:目的:在类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜(FLS)细胞中筛选并鉴定盘状结构域受体2(DDR2)的相互作用蛋白,并研究其对FLS细胞侵袭能力的影响。方法:首先利用免疫沉淀结合SDS-PAGE分离鉴定DDR2互作蛋白波形蛋白,进而采用免疫沉淀和激光共聚焦实验,进一步验证波形蛋白是DDR2的相互作用蛋白,最后采用Transwell实验考察波形蛋白对RAFLS细胞侵袭能力的影响。结果:Ⅱ型胶原刺激引起RAFLS细胞中DDR2的磷酸化水平升高,DDR2被活化,活化前后共有8个DDR2相互作用蛋白发生变化,经质谱分析,其中变化最大的是波形蛋白和膜联蛋白A2;在HEK293T细胞中,免疫共沉淀结果显示FcDDR2与波形蛋白存在相互作用;激光共聚焦结果显示在RAFLS细胞中,DDR2和波形蛋白存在共定位;下调RAFLS细胞中波形蛋白的表达后,细胞的侵袭能力较对照组显著下降。结论:波形蛋白是DDR2的相互作用蛋白,Ⅱ型胶原可引起RAFLS细胞的DDR2磷酸化水平升高,并通过波形蛋白促进RAFLS细胞的侵袭。
简介:目的:构建带Myc标签的LC3B—PLA2基因的真核表达质粒,获得LC3B—PLA2融合蛋白,并应用LC3B—PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,PCR扩增获得LCgB序列,与PLA2G]O拼接后插入pCMV—Myc载体,用构建的重组质粒转染HEK293T细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,用LC3B—PLA2与Atg4B共转染的方法检测Atg4B对LC3B的切割作用。结果:菌液PCR、重组质粒双酶切及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹结果表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,LC3B—PLA2真核表达蛋白能够应用于Atg4B对LC3B切割作用的研究。结论:构建了pCMV—Myc—LC3B—PLA2真核表达质粒,LC3B—PLA2融合蛋白在Atg4B对LC3B切割作用的研究中至关重要,为进一步研究Atg4B在自噬过程中的作用奠定了基础。